兔脂肪干细胞

方法简介  实验室分离的兔脂肪干细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔脂肪干细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔脂肪干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔脂肪干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

1. 细胞复苏：取出冻存兔脂肪干细胞冻存管，37℃水浴快速融化冻存样本，残余微小冰晶取出冻存管，酒精擦拭管壁消毒，移入安全柜，将细胞悬液缓慢加入脂肪干细胞完全培养基的离心管稀释冻存保护剂。

2. 离心去除冻存保护剂：离心管配平，1000rpm 离心 5min，离心结束，小心吸弃全部上层冻存上清液，保留管底干细胞沉淀。

3. 重悬制备单细胞悬液：加入预热兔脂肪干细胞完全培养基，轻柔反复吹打管底沉淀，充分打散干细胞团块，制备分散均匀单细胞悬液。

4. 计数接种铺瓶：活细胞计数，按照干细胞推荐接种密度接种细胞培养瓶，接种完成十字晃动培养瓶，让干细胞均匀分布瓶底。

5. 培养箱静置贴壁孵育：培养瓶放入 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱，静置孵育 24h，不挪动培养瓶，给予干细胞充足贴壁时间。

6. 首次换液清除悬浮死细胞：孵育 24h 后取出显微镜观察贴壁，弃旧培养基，去除悬浮死亡细胞碎片，添加预热新鲜完全培养基放回培养箱。

7. 维持培养传代诱导分化：每 2‑3 天更换培养基，监控细胞形态，细胞汇合达到 80%‑85% 进行传代扩增，也可直接开展成脂、成骨等诱导分化实验。