兔肌腱干细胞

方法简介  实验室分离的兔肌腱干细胞采用胶原酶、中性蛋白酶混合消化法并通过肌腱干细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔肌腱干细胞经CD44免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔肌腱干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔肌腱干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

细胞复苏解冻：取出冻存的兔肌腱干细胞冻存管，37℃水浴快速融解，残留少量冰晶即可，酒精擦拭管壁，超净台中将细胞悬液转移至含预热完全培养基的 15mL 离心管。

离心去除冷冻保护剂：离心机配平，1000rpm 离心 5min，小心吸取丢弃上清液，干细胞沉淀较为松散，吸液枪头远离管底沉淀，避免吸走细胞。

轻柔重悬干细胞沉淀：加入 3mL 兔肌腱干细胞专用完全培养基，缓慢吹打沉淀 10 次左右，充分打散细胞团块，禁止大力吹打，干细胞对机械损伤敏感度高。

计数接种铺瓶：完成细胞计数，接种密度设置 4×10⁴‑8×10⁴cells/cm²，添加足量干细胞完全培养基，十字晃动培养瓶，使细胞均匀分布，不要旋转摇晃。

培养箱静置孵育：放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置，前 24h 严禁挪动培养瓶，保障干细胞稳定贴壁，维持干细胞干性状态。

换液及状态监控：复苏 24h 后镜检贴壁情况，弃旧培养基，更换新鲜完全培养基，去除悬浮凋亡细胞，每 2‑3 天换液，密切观察细胞有无分化形态出现。

传代扩增保干性：细胞汇合 70%‑80% 即可传代，不可长到过满，PBS 清洗，低浓度胰酶短暂消化，镜下细胞变圆马上终止消化，收集细胞悬液离心，按比例分瓶扩增，避免过度传代引发干细胞分化。