兔肝动脉内皮细胞

方法简介  实验室分离的兔肝动脉内皮细胞采用混合酶消化法结合差速贴壁法，并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔肝动脉内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 兔肝动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔肝动脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

复苏准备：提前开启超净台紫外消毒 30min，取出完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰酶‑EDTA 消化液置于 37℃水浴锅复温；预热细胞培养箱设置 37℃、5% CO₂；取出 T25 细胞培养瓶，加入 5mL 内皮细胞专用完全培养基，放入培养箱预平衡 15min。

细胞冻存管复苏：从液氮罐取出兔肝动脉内皮细胞冻存管，快速投入 37℃水浴，轻轻晃动冻存管，1‑2min 内完成细胞融化，管内仅留微小冰晶即可，75% 酒精擦拭冻存管外壁后移入超净台。

细胞重悬接种：无菌吸取冻存管内细胞悬液，缓慢滴加到装有 5mL 预温完全培养基的 15mL 离心管中，轻柔吹打 3‑5 次混匀；1000r/min 离心 5min，弃去上清冻存保护液沉淀细胞；加入 2mL 完全培养基重悬细胞沉淀，转移至预平衡的 T25 培养瓶，轻轻十字摇晃培养瓶使细胞均匀铺板。

细胞贴壁培养：将培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂培养箱，静置培养 24h，期间禁止晃动培养瓶，让细胞充分贴壁；24h 后显微镜观察细胞贴壁状态，丢弃未贴壁的死细胞与碎片，更换新鲜完全培养基。

细胞传代消化：当细胞汇合度达到 80%‑85% 时进行传代；吸走旧培养基，3mL 无菌 PBS 轻柔冲洗细胞层 2 次，去除残留血清；加入 1mL 0.25% 胰酶‑EDTA 消化液，平放培养瓶浸润细胞，显微镜下观察细胞回缩变圆，立即加入 2mL 完全培养基终止胰酶消化。

细胞分瓶扩增：吹打瓶壁收集全部细胞悬液，转移至 15mL 离心管，1000r/min 离心 5min，弃上清；加入新鲜完全培养基重悬细胞，按照 1:2 传代比例分装至新 T25 培养瓶，补加足量培养基，十字摇匀后放回培养箱继续培养。

细胞保存 / 收样：扩增至目标细胞量后，可用于后续实验；如需冻存，离心收集细胞，加入细胞冻存液重悬，分装冻存管，程序降温盒梯度降温后转入液氮长期保存；若做功能实验，换对应诱导培养基开展后续检测。