人破骨细胞

方法简介  实验室分离的人破骨细胞采用机械分离法/密度梯度离心法和骨髓单核细胞诱导法制备而来。

质量检测  实验室分离的人破骨细胞经TRAP染色检测，纯度可达30%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人破骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 多核巨细胞

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人破骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

单核细胞诱导取材：选取人外周血单核细胞为诱导源，无菌分离单个核细胞，去除红细胞、粒细胞杂质。

基础细胞接种：纯化的单核细胞按2×10⁵个/mL接种，使用含诱导因子的专用基础培养基培养。

定向诱导分化：接种24h后更换含RANKL、M-CSF诱导因子的完全培养基，启动单核细胞向破骨细胞定向分化。

隔日诱导换液：每48h更换新鲜诱导培养基，持续补充分化因子，维持分化微环境，连续诱导7-9天。

多核细胞筛选：诱导结束后，筛选多核、体积较大的成熟破骨细胞，剔除未分化单核细胞。

骨吸收功能检测：通过骨片吸收坑实验验证细胞功能，具备正常骨吸收活性即为合格细胞。

即时实验使用：成熟破骨细胞无增殖能力、不可冻存传代，诱导成功后立即用于实验，避免细胞失活。