大鼠嗅鞘细胞

方法简介  实验室分离的大鼠嗅鞘细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法、结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠嗅鞘细胞经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠嗅鞘细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元、上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1代，不建议传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠嗅鞘细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

取大鼠嗅球与嗅神经纤维组织，剥离硬脑膜，冷缓冲液清洗组织表面。

组织剪剪碎组织，木瓜蛋白酶消化液 37℃孵育 22min 解离细胞。

终止消化后吹打制备悬液，通过振荡摇床去除成纤维细胞杂质。

接种于多聚鸟氨酸包被培养皿，添加嗅鞘细胞专用培养液。

培养第 3 天更换新鲜培养基，观察双极、梭形细胞形态。

GFAP 与 p75 双染鉴定嗅鞘细胞纯度。

用于脊髓损伤神经修复、嗅神经再生相关体外实验。