大鼠心肌细胞

方法简介  实验室分离的大鼠心肌细胞采用胶原酶-胰酶联合消化法结合差速贴壁法，并用化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠心肌细胞经α-Sarcomeric actin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠心肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠心肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取腓肠肌/心肌等目标肌肉组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、胰岛素

分离纯化步骤

取实验动物目标肌肉组织，用预冷PBS冲洗去除血液和结缔组织

剪碎组织后先经机械法分散，再加入0.25%胰蛋白酶37度消化15分钟

加入II型胶原酶继续消化30-40分钟，期间振荡2-3次

过滤后300g离心8分钟收集细胞沉淀

采用差速贴壁法或Percoll密度梯度离心纯化肌源性细胞

原代培养要点

骨骼肌细胞：使用DMEM+20%FBS培养基培养肌源性干细胞，换用2%FBS诱导分化

心肌细胞：使用M199+20%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈节律性搏动

肌卫星细胞可在培养7-10天后融合形成多核肌管(Myotube)

心肌细胞培养需注意电刺激培养可促进成熟和同步搏动

常见问题优化

肌细胞融合率低：降低培养皿FBS浓度至2%可促进肌管形成

心肌细胞搏动不协调：使用电刺激培养装置(1Hz，2ms脉冲)可促进同步搏动

成纤维细胞污染：采用Pre-plating差速贴壁法2-3次可有效富集肌源性细胞

采用 Langendorff 逆行灌流装置，经主动脉插管灌注无钙缓冲液冲洗心脏残留血液。

切换含 Ⅱ 型胶原酶的消化灌流液持续循环灌流，消化心室心肌组织。

消化结束后摘取心室剪碎，轻柔吹打释放心肌细胞，逐步恢复钙离子浓度。

梯度离心分离成年心肌细胞与非心肌杂细胞，弃上清重悬细胞沉淀。

将细胞接种于层粘连蛋白包被培养板，使用无血清心肌细胞维持液培养。

持续监测心肌细胞自发搏动频率与节律，避免培养基钙浓度剧烈波动。

可开展心肌收缩力检测、缺氧复氧损伤及心血管药物药效评价实验。