大鼠神经干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠神经干细胞采用胰蛋白酶消化后差速贴壁，结合神经干细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠神经干细胞经Nestin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠神经干细胞完全培养基(含B-27 Supplement、EGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 球形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： Accutase消化液或0.25%胰蛋白酶

大鼠神经干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

实验准备：配制神经干细胞无血清增殖培养基，准备无菌分离耗材、细胞筛，提前预热缓冲液，选取胚胎大鼠脑组织。

无菌取材：无菌摘取胚胎大鼠大脑组织，冰上剔除脑膜、血管及杂质，保留神经干细胞富集区域组织。

组织处理：冰上精细剪碎脑组织，轻柔研磨松散，最大程度释放神经干细胞。

酶解消化：温和复合酶液37℃消化20min，轻柔震荡，避免干细胞干性损伤。

纯化离心：无血清培养基终止消化，过滤纯化，1000rpm低速离心5min，收集干细胞。

接种培养：干细胞专用培养基重悬，悬浮接种培养，恒温低氧环境培育神经球。

常规养护：每2天半量换液，不传代不扰动神经球，维持干细胞干性，按需分化或扩增。