大鼠破骨细胞

方法简介  实验室分离的大鼠破骨细胞采用机械分离法/密度梯度离心法和骨髓单核细胞诱导法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠破骨细胞经TRAP染色检测，纯度可达30%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠破骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 多核、巨细胞

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠破骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

无菌取大鼠双侧股骨、胫骨，剔除肌肉软组织，预冷 α-MEM 培养基反复冲洗骨髓腔获得骨髓细胞悬液。

细胞悬液过筛去除骨渣，离心收集沉淀，加入红细胞裂解液裂解红细胞，洗涤获得骨髓单核细胞。

用含 M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的完全培养基重悬细胞，按适宜密度接种培养板，37℃孵育培养 3d 获得破骨前体细胞。

吸除旧培养基，更换同时添加 M-CSF 与 RANKL 诱导因子的分化培养基，开始定向诱导破骨分化。

每 2 天半量更换新鲜诱导培养基，持续培养 4–6d，观察多核巨大细胞形成情况。

进行 TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色鉴定多核破骨细胞，统计成熟破骨数量。

后续可开展骨吸收窝实验、药物干预、基因检测等功能检测操作。