大鼠淋巴管内皮细胞

方法简介  实验室分离的大鼠淋巴管内皮细胞采用中性蛋白酶消化法结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠淋巴管内皮细胞经VEGFR3免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 大鼠淋巴管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠淋巴管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

一、实验前准备

显微解剖器械、细胞筛；EGM-2 内皮专用培养基、胶原酶 Ⅰ、胰酶、PBS、肝素。

操作台紫外灭菌，配制抗凝洗涤液。

二、取材与预处理

摘取大鼠肠系膜淋巴管，小心分离肠系膜细小淋巴管丛，剔除血管与脂肪组织。

预冷含肝素 PBS 冲洗管腔内部，去除淋巴液与血细胞。

三、细胞分离与消化

淋巴管剪碎后 Ⅰ 型胶原酶 37℃消化 30min，间断吹打解离内皮细胞。

胰酶二次消化 10min，血清终止消化。

充分吹打制备单细胞悬液。

四、纯化与接种培养

滤网过滤离心，内皮培养基重悬接种包被明胶的培养板。

利用内皮细胞特异性贴壁特性纯化，24h 换液去除杂细胞。

采用 CD31/Prox1 后续鉴定，常规传代培养。