大鼠角膜基质细胞

方法简介  实验室分离的大鼠角膜基质细胞采用混合胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠角膜基质细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠角膜基质细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠角膜基质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

一、实验前准备

显微精细镊、角膜剪灭菌；内皮专用 DMEM 培养基、0.1% 胰酶、PBS；培养皿包被明胶。

全程低温操作，防止内皮细胞脱落损伤。

二、取材与预处理

摘取大鼠眼球，沿角膜缘剪开，去除晶状体虹膜，翻转角膜后用显微镊轻轻刮取后极内皮组织。

PBS 收集刮取的内皮细胞团，少量漂洗。

三、细胞分离与消化

收集的内皮组织团加入胰酶 37℃消化 8min，轻柔吹打。

培养基立刻终止消化，避免内皮细胞过度消化凋亡。

滤网过滤大组织残渣。

四、纯化与接种培养

低速离心浓缩细胞，专用培养基重悬接种包被培养皿。

接种后静置 48h 再首次换液，减少细胞脱落。

每 2~3d 换液，内皮细胞呈多边形铺路石样生长，传代 1 代内使用，该细胞体外增殖能力弱，不建议多次传代。