大鼠骨骼肌细胞

方法简介  实验室分离的大鼠骨骼肌细胞采用混合胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠骨骼肌细胞经α-Sarcomeric actin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠骨骼肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠骨骼肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取腓肠肌/心肌等目标肌肉组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、胰岛素

分离纯化步骤

取实验动物目标肌肉组织，用预冷PBS冲洗去除血液和结缔组织

剪碎组织后先经机械法分散，再加入0.25%胰蛋白酶37度消化15分钟

加入II型胶原酶继续消化30-40分钟，期间振荡2-3次

过滤后300g离心8分钟收集细胞沉淀

采用差速贴壁法或Percoll密度梯度离心纯化肌源性细胞

原代培养要点

骨骼肌细胞：使用DMEM+20%FBS培养基培养肌源性干细胞，换用2%FBS诱导分化

心肌细胞：使用M199+20%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈节律性搏动

肌卫星细胞可在培养7-10天后融合形成多核肌管(Myotube)

心肌细胞培养需注意电刺激培养可促进成熟和同步搏动

常见问题优化

肌细胞融合率低：降低培养皿FBS浓度至2%可促进肌管形成

心肌细胞搏动不协调：使用电刺激培养装置(1Hz，2ms脉冲)可促进同步搏动

成纤维细胞污染：采用Pre-plating差速贴壁法2-3次可有效富集肌源性细胞

一、实验前准备

1. 器械：无菌解剖器械、细胞筛、离心管、培养皿

2. 试剂：无菌 PBS、0.2%Ⅱ 型胶原酶、DMEM 高糖培养基、胎牛血清、双抗

3. 材料：4~6 周龄大鼠、培养板、移液枪

二、取材与预处理

1. 大鼠处死消毒，分离四肢骨骼肌，去除筋膜淤血组织

2. PBS 冲洗血迹，无菌条件下剪切成糊状组织块

三、细胞分离与消化

1. 组织加入 Ⅱ 型胶原酶，37℃摇床消化 60min

2. 吹打打散组织团，培养基终止消化，过 70μm 滤网

3. 收集细胞悬液离心沉淀细胞

四、纯化与接种培养

1. 离心后 PBS 洗涤细胞沉淀 2 次，重悬于完全培养基

2. 梯度差速离心去除杂细胞，调整细胞密度

3. 接种培养瓶，低血清分化培养基诱导肌管形成，常规恒温培养