大鼠巩膜成纤维细胞

大鼠巩膜成纤维细胞

采用组织块贴壁法从Sprague-Dawley大鼠的巩膜成纤维细胞来源组织中分离成纤维细胞，经 0.25% 胰蛋白酶消化传代后，接种于未包被培养皿中，使用 DMEM 低糖培养基（含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）培养；通过免疫荧光染色检测成纤维细胞标志物 CD90（Thy-1）、CD44、vimentin 及 FSP-1 表达，结合细胞形态学观察（梭形、长突起 morphology）和碱性磷酸酶（ALP）活性检测确认细胞身份。

产品名称：大鼠巩膜成纤维细胞

英文名称： Rat Scleral Fibroblasts

组织来源： 巩膜组织

默认种属 ：SD大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠巩膜成纤维细胞采用混合胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠巩膜成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠巩膜成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠巩膜成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

试剂 无菌 PBS、0.25% 胰蛋白酶、Ⅰ 型胶原酶、DMEM 高糖 + 10% FBS + 双抗完全培养基、庆大霉素稀释液。

耗材 显微手术剪、显微镊、眼科器械、培养皿、细胞筛、离心管。

成年 SD 大鼠，术前器械灭菌，操作台紫外照射 30min。

二、取材与预处理

大鼠麻醉处死，眼部 75% 酒精消毒，显微操作下完整摘取双侧眼球。

PBS 浸泡眼球，小心剪开眼球角膜，去除晶状体、视网膜、脉络膜色素层组织，仅保留白色巩膜组织。

巩膜组织用含双抗 PBS 漂洗 5 次，彻底清除色素细胞与残留眼内组织。

三、细胞分离与消化

将巩膜剪切成＜1mm³ 组织碎块，移入离心管加入胶原酶，37℃水浴消化 30min。

再加入等量胰酶，继续消化 15min，期间反复吹打促进细胞脱落。

加入胎牛血清终止消化，细胞悬液过 200 目筛去除组织碎片。

四、纯化与接种培养

滤液 1000×g 离心 6min，弃上清，完全培养基重悬沉淀，离心洗涤 2 次。

接种于培养瓶，37℃5% CO₂培养，24h 后首次换液去除未贴壁死细胞与杂细胞。

细胞呈梭形成纤维样生长，每 2~3 天换液；细胞汇合至 80% 可常规胰酶消化传代。

1.操作过程中需严格无菌操作，任何微生物污染都会导致细胞死亡或实验结果偏差。

2.培养器皿需用0.1%明胶溶液包被30分钟以上，去除未结合明胶后使用。

3.该细胞类型体外培养寿命有限，原代细胞通常在5-10代内出现衰老现象。

4.培养基中需添加20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以维持细胞增殖活性。

5.传代时用PBS轻柔洗涤2次后加入0.25%胰蛋白酶，室温作用2-3分钟收集细胞。