猪流行性腹泻病毒/猪 Delta 冠状病毒（PEDV/ PDCov) 核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）

【产品名称】

通用名称：猪流行性腹泻病毒/猪 Delta 冠状病毒（PEDV/ PDCov)

核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）

英文名称：Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine delta coronavirus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包装规格】50 T/盒

【产品用途】

本试剂盒适用于检测测猪临床样品（猪小肠和新鲜粪便）或细胞培养物中的猪流行性腹泻病毒和猪Delta冠状病毒，适用于猪流行性腹泻病毒和猪Delta冠状病毒感染的辅助诊断及流行病学调查。

【产品简介】

本试剂盒分别对猪流行性腹泻病毒和猪Delta冠状病毒设计特异性引物和探针，用一步法荧光RT-PCR 技术对病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【产品内容】

【贮存及有效期】

-20 ℃避光保存与运输，反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【注意事项】

PCR方法具有极高的灵敏度，应用于临床检验必须采取严格的质控措施才能保证实验结果的准确性，在样本采集、核酸提取、扩增、产物分析、结果报告的整个流程都要做好质量控制。本项详细的列出了良好的动物疫病PCR检测实验室所应遵循的操作规范。

1. 病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。

2. 实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区），每一区域都须有专用的仪器设备。各区域所用的仪器设备必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

3. 样本处理应在样本制备区指定的生物安全柜内进行。

4. RNA提取过程要注意防止RNA降解，尽量缩短操作时间，建议使用与科前公司提供的商品化核酸提取试剂盒配套使用。

5. 实验操作过程中，操作者必须戴手套，当怀疑手套有污染时就要更换手套。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效的防止污染的措施。

6. 用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液频繁地冻融，贮存试剂应分装冰冻贮存。分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定，试剂分装应在超净台中进行。

7. 在打开含有反应液或样本的离心管前，都要完全溶解后混匀，快速离心数秒。

8. 小心的打开或关闭各样本管，避免样本喷洒或喷溅出来。

9. 使用带滤芯的一次性吸头操作，吸头不要暴露于空气中。

10. 根据所使用荧光定量PCR仪的要求选择合适的耗材，采用光学平盖的PCR管或八联管。

11. 不要把扩增产物带到反应配制区。

12. 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器(含1%次氯酸钠溶液)内。含有PCR产物的任何废液必须收集到1 mol/L盐酸中，应到远离PCR实验室的地方弃掉。

13. 经常使用有效氯含量2 g/L的次氯酸钠清洁实验台及设备。

【样本采集】

肛拭子样品：将灭菌的医用棉签插入肛门（以棉签棉花部分全部插入肛门为准），同一方向转动3次，确保充分获取粪便。

粪便样品、肠道样品和母猪乳汁样品的采集参考 GB/T36871-2018 以及 SN/T5124-2019。

【样本前处理】

肛拭子样品处理：将肛门拭子放在盛有 0.8mL 灭菌 PBS 的无菌 EP 管中，涡旋或振荡 10min，反复冻融 2 次， 4℃条件下14600×g 离心10min，取上清转入新的EP管中，编号备用。

粪便样品、肠道样品和母猪乳汁样品处理参考 GB/T 36871-2018 以及 SN/T 5124-2019 。

【操作步骤】

1.试剂准备：（试剂准备区）

（1）从-20 ℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

（2）在冰上准备主反应混合液，核算当次实验所需要的反应数（n），计算当次实验所需要的各种试剂量。考虑加样误差，可多配出5-10% 的量。

n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+样本数+误差预留量

（3）在适当容积的无核酸酶离心管中加入上述试剂，混匀后快速离心数秒。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。

（4）将PCR反应管转移至样本准备区。

2.核酸提取：（样本准备区）

病毒RNA的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”。

阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于PCR扩增。

3.加样：（样本准备区）

每管加入样本模板5 μL，阳性对照和阴性对照也各加5 μL。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。

4. PCR扩增：（核酸扩增区）

（1）将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，记录放置顺序。

（2）设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；荧光通道选择： 荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM、CY5，淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

【结果判定】

1.条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。

2.对照标准

阳性对照：Ct值≤32并出现特征性扩增曲线，

阴性对照：无特异性扩增曲线或无Ct值；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

3.结果描述及判定

FAM 通道为猪流行性腹泻病毒检测结果，CY5 通道为猪 Delta 冠状病毒检测结果

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

【参考标准】

《核酸扩增检测用试剂（盒）（YY/T1182-2010）》

《转基因产品检测实验室技术要求（GB/T 19495.2-2004）》

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