禽流感病毒 H5/H7（AIV-H5/H7）核酸检测试剂盒（双重荧光 PCR 法）

【产品名称】

通用名称：禽流感病毒 H5/H7（AIV-H5/H7）核酸检测试剂盒（双重荧光 PCR 法）

英文名称：Avian Influenza Virus subtype H5 and H7 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50 T/盒

【产品用途】

适用于检测标本中的禽流感病毒 H5/H7 亚型 RNA，适用于禽流感病毒 H5/H7 亚型感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

【产品简介】

禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类传染病，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽均可感染，发病情况差别较大，有的出现急性死亡，有的无症状带毒。AIV 抗原变异性强，宿主范围广泛，且亚型之间无交叉保护性，使得禽流感频繁爆发。高致病性禽流感主要由 H5 或 H7亚型 AIV 引起， 潜伏期极短，突然爆发，发病率和死亡率高达 100%。早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的关键。

本试剂盒根据禽流感病毒 H5/H7 亚型的 HA 基因，分别设计特异性的引物和探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽流感病毒 H5/H7 亚型 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【产品组成】

【贮存及有效期】

-20 ℃避光保存与运输，反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【注意事项】

PCR 方法具有极高的灵敏度，应用于临床检验必须采取严格的质控措施才能保证实验结果的准确性，在样本采集、核酸提取、扩增、产物分析、结果报告的整个流程都要做好质量控制。本项详细的列出了良好的动物疫病 PCR 检测实验室所应遵循的操作规范。

1.    病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。

2.    实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区），每一区域都须有专用的仪器设备。各区域所用的仪器设备必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

3.    样本处理应在样本制备区指定的生物安全柜内进行。

4.    RNA 提取过程要注意防止 RNA 降解，尽量缩短操作时间，建议使用与科前公司提供的商品化核酸提取试剂盒配套使用。

5.    实验操作过程中，操作者必须戴手套，当怀疑手套有污染时就要更换手套。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效的防止污染的措施。

6.    用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液频繁地冻融，贮存试剂应分装冰冻贮存。分装体积根据通常在实验室内一

次测定所需的扩增反应数来决定，试剂分装应在超净台中进行。

7.    在打开含有反应液或样本的离心管前，都要完全溶解后混匀，快速离心数秒。

8.    小心的打开或关闭各样本管，避免样本喷洒或喷溅出来。

9.    使用带滤芯的一次性吸头操作，吸头不要暴露于空气中。

10.  根据所使用荧光定量 PCR 仪的要求选择合适的耗材，采用光学平盖的 PCR 管或八联管。

11.  不要把扩增产物带到反应配制区。

12.  用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器(含 1%次氯酸钠溶液)内。含有 PCR 产物的任何废液必须收集到 1 mol/L 盐酸中，应到远离 PCR 实验室的地方弃掉。

13.  经常使用有效氯含量 2g/L 的次氯酸钠清洁实验台及设备。

【样本采集与前处理】

待检活禽可根据动物种类分别采集咽喉拭子、泄殖腔拭子或鼻拭子。病死或扑杀禽可取脑、肝、脾、肾、喉气管、胸肌、心肌、肺及气管等组织。

咽喉拭子采集处理方法：将棉拭子插入口腔至咽的后部直达气管，轻轻擦拭并慢慢旋转，沾上气管分泌物，将采样后的拭子置于含 1.2- 1.4 mL PBS 液中漩涡振荡，弃去棉拭子再 8000 rpm 离心 20 秒，取上清备用。

泄殖腔拭子采集处理方法：将棉拭子插入泄殖腔约 1.5-2.0 cm，旋转后沾取少量粪便，将采样后的拭子置于含 1.2- 1.4 mL PBS 液中漩涡振荡，弃去棉拭子再 8000 rpm 离心 20 秒，取上清备用。

鼻拭子采集处理方法：将棉拭子深入鼻腔来回刮 2-3 次并旋转，取分泌物，将采样后的拭子置于含 1.2- 1.4 mL PBS 液中漩涡振荡，弃去棉拭子再 8000 rpm 离心 20 秒，取上清备用。

组织样品采集处理方法：剪取 0.5 g 样本，加 1.5mL PBS 或生理盐水缓慢研成匀浆，转移匀浆液到离心管中，8000 rpm 离心 20 秒，取上清备用。

【操作步骤】

1.试剂准备：（试剂准备区）

（1）从-20℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

（2）在冰上准备主反应混合液，核算当次实验所需要的反应数（n），计算当次实验所需要的各种试剂量。考虑加样误差，可多配出5- 10%  的量。

n =阴性对照数（1T）+ 阳性对照数（1T）+样本数+误差预留量

（3）在适当容积的无核酸酶离心管中加入上述试剂，混匀后快速离心数秒。按照 20μL/管分装量将试剂分装至 PCR 反应管中。

（4）将 PCR 反应管转移至样本准备区。

2.核酸提取：（样本准备区）

（1）病毒 RNA 的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸 DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）”。

阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于 PCR 扩增。

3.加样：（样本准备区）

每管加入样本模板 5μL ，阳性对照和阴性对照也各加 5μL 。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。

4. PCR 扩增：（核酸扩增区）

（1）将 PCR 反应管放置在仪器样本槽相应位置，记录放置顺序。

（2）设置仪器运行参数，进行 PCR 扩增，反应体系设置为 25μL 。荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM 、VIC ， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE ，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

【结果判定】

1.条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。

2.对照标准

阳性对照：Ct 值≤32 并出现特征性扩增曲线，

阴性对照：Ct 值>38 或无 Ct 值

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

3.结果描述及判定

FAM  通道为禽流感病毒 H5  亚型检测结果，VIC  通道为禽流感病毒H7  亚型检测结果

阳性：当被检样本出现特征性扩增曲线且 Ct值≤35。

可疑：35<Ct 值≤38 并出现特征性扩增曲线的样本，需重新取样提取RNA 进行检测，若重新检测后仍 35<Ct 值≤38，且有特征性扩增曲线，可判定为阳性，否则判定为阴性。

阴性：被检样本 Ct 值>38 或无 Ct 值。

对于某些未呈现特征性扩增曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。

【参考标准】

《禽流感检疫技术规范（SN/T1182-2010）》

《核酸扩增检测用试剂（盒）（YY/T1182-2010）》

《基因检验实验室技术要求（SN/T1193-2003）》 【生产企业】  武汉光启生物科技有限公司

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