己糖激酶(HK)测试盒

商品属性：

商品介绍：

HK（EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

核心反应原理：偶联酶促分光法：己糖激酶催化葡萄糖 + ATP 生成葡萄糖‑6‑磷酸 (G‑6‑P)+ADP；偶联葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶 (G6PDH) 催化 G‑6‑P 氧化，产生 NADPH。

靶标反应路径：Glc+ATP\(\xrightarrow{HK}\)G‑6‑P+ADP；G‑6‑P+NADP⁺$\xrightarrow {G6PDH}$6‑磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH。

吸光信号来源：NADPH 在 340 nm 产生紫外吸收；A340 上升速率等于 HK 催化速率。

定量计算原理：连续读取 340nm 吸光度增量；以每分钟生成 NADPH 量计算 HK 酶活。
样本前处理方法：

血清/血浆样本

血清制备：室温自然凝固15-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟，取上清液。

血浆制备：使用EDTA或肝素钠抗凝，采血后轻轻颠倒混匀，同上述条件离心取上清。

保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1个月，避免反复冻融。

组织样本

称取约0.1g组织，按1:9比例加入预冷的提取液（如0.1g组织+0.9mL提取液），冰浴匀浆。

10000转/分4℃离心10分钟，取上清液待测，剩余样本-20℃保存。

细胞样本

收集细胞沉淀，加入提取液（10^6个细胞/1mL提取液），吹打混匀后超声破碎（冰浴，功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）。

10000转/分4℃离心10分钟，取上清液待测。

尿液样本

取新鲜尿液，2000转/分离心10分钟，取上清液。

若尿液浑浊，需用0.22μm滤膜过滤后再检测。

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测定操作步骤：

比色法/COD-PAP法/分光光度法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500~520nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入10mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入20mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后37℃水浴15min，记录500~520nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将FC标准品稀释成0、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1μmol/L系列浓度，同样处理，测定500~520nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度