羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)测试盒

商品属性：

商品介绍：

羟甲基戊二酰辅酶A合酶是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶，催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA。

测定原理

HMGCS催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA，同时产生CoASH，使DTNB转化为黄色的TNB，在412nm下有特征吸光值。

所需的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

DTNB 巯基释放速率法：HMGCS 催化乙酰‑CoA + 乙酰乙酰‑CoA→HMG‑CoA+CoA‑SH；释放的巯基与 DTNB 显色，412 nm 速率法测酶活。

偶联 HMG‑CoA 裂解酶紫外法：产物 HMG‑CoA 经裂解酶生成乙酰乙酸，再偶联 NADH 氧化反应，340nm 读数。

荧光巯基探针动力学法：生成游离 CoA‑SH，荧光信号随时间增强，信号增速表征酶活性。

HMG‑CoA 产物终点比色法：终止酶促反应后，特异性显色试剂与 HMG‑CoA 反应显色，505 nm 终点测定。
样本前处理方法：

植物组织样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆离心：11000g，4℃离心10min，弃沉淀取上清，置冰上待测

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。

细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万微生物或细胞加入1mL提取液），超声波破碎微生物或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

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测定操作步骤：

标准曲线绘制：

取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准系列溶液，补加提取液至1mL。

每管加入2mL底物缓冲液，37℃水浴预热5分钟。

加入0.5mL显色剂，混匀后37℃水浴准确反应10分钟。

立即加入2mL终止液终止反应，于405nm波长下测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样本检测：

取1mL待测样本（若样本活性过高，需用提取液稀释），加入2mL底物缓冲液，37℃水浴预热5分钟。

加入0.5mL显色剂，混匀后37℃水浴准确反应10分钟。

立即加入2mL终止液终止反应，于405nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算样本中β-GAL活性。

微量酶标仪法操作步骤

加样：在96孔板中设置空白孔、标准孔、样本孔，每孔加50μL对应溶液。

反应：每孔加入100μL底物缓冲液，37℃孵育30分钟。

终止：每孔加入50μL终止液。

读数：用酶标仪在405nm波长下测定吸光度，计算酶活性。