羟甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGCS）测试盒 新品

羟甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGCS）测试盒

测定意义与原理

测定意义

HMGCS是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶，催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA。其活性测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测肝肾功能损伤、动脉粥样硬化、心血管疾病、肿瘤等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解细胞内胆固醇合成、酮体生成和细胞增殖机制药物研发：筛选降脂药物、抗癌药物等

测定原理

HMGCS催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA，同时产生CoASH，使DTNB转化为黄色的TNB，在412nm下有特征吸光值。反应式如下： 乙酰CoA+乙酰乙酰CoA→HMGCS羟甲基戊二酰CoA+CoASH乙酰CoA+乙酰乙酰CoAHMGCS羟甲基戊二酰CoA+CoASH CoASH+DTNB→CoA-S-TNB+黄色TNBCoASH+DTNB→CoA-S-TNB+黄色TNB

试剂盒组成

可见分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 用于提取样本中的HMGCS

试剂一 粉剂×1瓶 含乙酰CoA，反应底物

试剂二 粉剂×1瓶 含乙酰乙酰CoA，反应底物

试剂三 液体25mL×1瓶 含DTNB溶液，显色剂

试剂四 液体5mL×1瓶 含缓冲液，用于配制工作液

标准品 液体×1支 含HMGCS标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗HMGCS单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗HMGCS抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.156-10ng/mL HMGCS标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度法：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿

微量法：酶标仪（412nm检测通道）、96孔板

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

细菌/细胞样本收集：收集500万细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清(浆)样品：直接检测

测定操作步骤

可见分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零试剂配制：临用前将试剂一、试剂二分别用蒸馏水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融样本测定：

取500μL样本上清，加入125μL试剂一、125μL试剂二和250μL试剂三，迅速混匀

记录412nm下初始吸光值A1和4min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1标准曲线绘制：将HMGCS标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定4min内吸光值变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol TNB的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟生成1nmol TNB的酶量

U/L：每升样本每分钟生成1nmol TNB的酶量

可见分光光度法/微量法计算公式

HMGCS活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×109HMGCS活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×109

ΔA样本：样本管吸光度变化值

ΔA空白：空白管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本体积（L）

ε：TNB摩尔消光系数（13.6×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

HMGCS含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数HMGCS含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 可见分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~50U/L 0.156-10ng/mL

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.5% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤3.3% CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存3个月有效 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免HMGCS失活；-20℃可保存3个月

操作过程需在4℃冰浴中进行，避免酶失活

若样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测

试剂使用：

试剂临用前配制，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后需立即进行比色测定，确保数据准确

比色测定初始读数（20秒读数）0.4左右为理想状态

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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