谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)测试盒

谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（DTNB法）

微量法100管48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx，EC1.11.1.9）代表一种具有过氧化物酶活性的酶家族，GPx能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物，从而保护生物膜免受 ROS 的损害，维持细胞的正常功能，同时还具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等作用。

测定原理：

谷胱甘肽过氧化物酶可催化H₂O₂氧化GSH生成GSSG，GSH和DTNB反应生成黄色的TNB，产物在412nm处具有特征吸收峰，通过吸光值下降速率即可表征谷胱甘肽过氧化物酶的活性。

试剂组成和配制：

试剂一：临用前每瓶加入2mL提取液，充分溶解混匀，4℃避光条件下可保存1周。

试剂二工作液：临用前加入5mL纯水，充分混匀，4℃避光条件下可保存2周。

试剂五：临用前加入2.5mL纯水，充分混匀，4℃避光条件下可保存2周。

标准品：临用前加入405μL纯水，充分混匀，即为80μmol/mL GSH母液，4℃避光条件下可保存2周。

需自备仪器和用品：

酶标仪、电子天平、台式离心机、研钵/匀浆器、可调式移液器、96孔板、振荡仪、纯水、冰。

样本处理：

1. 组织：按照组织质量(g) : 提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后12000g，4℃，离心10min后取上清置于冰上待测。

2. 细菌和细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间

3min）；然后12000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清（浆)、培养液等液体样本：吸取100μL液体样本，加入100μL提取液充分混匀，4℃12000g离心10min，取上清置于冰上待测。

测定步骤：

1. 酶标仪预热30min以上。

2. 酶促反应步骤：

3. 显色反应步骤

酶活性计算公式：

标准条件下测定的回归方程为y=1.362x-0.0054，R²=0.9998，x为标准品浓度（µmol/mL），y为吸光值。

1.按蛋白浓度计算：

活性单位定义：在37℃反应条件下，每毫克蛋白每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。

GPx(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×10³×V反总]÷(Cpr×V样)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷Cpr

2.按样本质量计算：

活性单位定义：在37℃反应条件下，每克样本每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。

GPx(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×10³×V反总]÷(W×V样÷V提)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷W

3.按细胞数量计算：

活性单位定义：在37℃反应条件下，每10⁴个细胞每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。

GPx(nmol/min/10⁴ cell)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×10³×V反总]÷(500×V样÷V提)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷500

4.按液体体积计算：

活性单位定义：在37℃反应条件下，每毫升液体每分钟氧化1nmolGSH为1个酶活单位。

GPx(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×10³×V反总]÷V样÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)

V样：酶促反应样本体积，0.02mL；V反总：酶促反应总体积，0.17mL；V提：样本提取中提取液加入量，1mL；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞数量（万个）；10³：1μmol=10³nmol；T：反应时间，5min。

注意事项：

1. ΔA线性范围为0.02-1.3，可测定剩余谷胱甘肽浓度范围0.02-1μmol/mL；如果样本ΔA大于1.3，建议用提取液稀释待测样本后重新测定（计算公式中乘以相应稀释倍数），如果ΔA小于0.05，建议适当增加样本量。

2. 建议一次不要做过多样本以免检测时间过长影响显色，防止测定结果不准确。

实验实例：

1. 称取0.2g牛肝，加入1mL提取液研磨匀浆，取上清用提取液梯度稀释，后按测定步骤操作，结果如下：

2. 称取0.1g现取紫叶李叶片，加入1mL提取液研磨匀浆，取上清用提取液梯度稀释，后按测定步骤操作，结果如下：

参考文献：

[1]Flohé L, Günzler W A. [12] Assays of glutathione peroxidase[M]. Methods in enzymology. Academic Press, 1984, 105: 114-120.

[2]杨继轩, 任治鹏, 徐悦, 等. 几种禾本科作物幼苗期谷胱甘肽过氧化物酶活力研究[J]. 现代农业科技, 2018 (5): 1-3.

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