谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX，EC1.11.1.9）是体内重要的抗氧化酶，主要功能包括：清除自由基：催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原过氧化氢、有机氢过氧化物等，保护生物膜免受氧化损伤抗氧化防御：与超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GR）共同构成抗氧化防御系统疾病关联：GPX活性降低与多种疾病相关，如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等药物研究：GPX作为药物靶点，用于筛选抗氧化剂和抗癌药物

测定原理

采用偶联酶法检测GPX活性，反应式如下： H2O2+2GSH→GPXGSSG+2H2OH2O2+2GSHGPXGSSG+2H2O GSSG+NADPH+H+→GR2GSH+NADP+GSSG+NADPH+H+GR2GSH+NADP+ 通过监测NADPH在340nm处吸光度下降速率计算GPX活性。

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）

台式高速离心机（≥8000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）

必备耗材

1mL石英比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

液氮（用于样本速冻）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定

细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释

测定操作步骤

紫外分光光度法操作

试剂准备：

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存

试剂二：液体1mL×1支，-20℃保存

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加500μL蒸馏水溶解

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存，用时加500μL蒸馏水溶解

检测工作液：试剂一1.0mL + 试剂二50μL + 试剂三50μL + 试剂四50μL，现配现用

检测工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中预热10min以上

预温育：

分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零

反应启动：

非酶促反应管：取比色皿，依次加入工作液900μL + 样本100μL

混匀，在340nm波长下记录0min（A1）和5min（A2）时的吸光度值

酶促反应管：取比色皿，依次加入工作液900μL + 样本100μL + 过氧化氢溶液50μL

混匀，在340nm波长下记录0min（A3）和5min（A4）时的吸光度值

计算ΔA：ΔA = (A3 - A4) - (A1 - A2)

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液90μL + 样本10μL37℃预温育5min，加入过氧化氢溶液5μL后立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟氧化1μmol NADPH的酶量

U/mL：每mL样本每分钟氧化1μmol NADPH的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟氧化1μmol NADPH的酶量

计算公式

GPX活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TGPX活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总

ΔA：5min内吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样测：测定时加入样本体积（0.1mL）

T：反应时间（5min）

简化公式

组织样本：GPX（U/g鲜重）= 0.322 × ΔA ÷ W

液体样本：GPX（U/mL）= 0.322 × ΔA

蛋白样本：GPX（U/mgprot）= 0.322 × ΔA ÷ Cpr

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触

试剂使用：

NADPH溶液对光敏感，配制后需避光保存

检测工作液需现配现用，避免NADPH氧化

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）

若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算

质量控制：

每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定

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