ATCC 33291空肠弯曲菌食品检验质控

导读： 空肠弯曲菌是全球细菌性胃肠炎的首要病原菌之一，在禽肉产业链中的高污染率使其成为食品安全检测的重点监控对象。ATCC 33291是该菌的标准质控菌株，在GB 4789.9和ISO 10272等检测方法中被指定为参考菌株。本文从微需氧培养技术的特殊性出发，详解该菌株的特性、检测流程及质控应用要点。

菌株基本信息

ATCC 33291的学名为 Campylobacter jejuni subsp. jejuni，属于弯曲菌属中最常见的人畜共患种。该菌是微需氧菌，对培养气氛的要求极为苛刻——需要5% O₂、10% CO₂和85% N₂的混合气体环境，这一特性使其成为食品检测实验室中培养难度最高的细菌之一。

| 项目 | 内容 |

|------|------|

| 学名 | Campylobacter jejuni subsp. jejuni |

| ATCC编号 | 33291 |

| 生物安全等级 | BSL-2 |

| 推荐培养基 | Bolton肉汤（增菌）、CCDA/mCCDA琼脂（分离） |

| 培养温度 | 42°C（选择性培养）/ 37°C（部分方法） |

| 培养气氛 | 微需氧（5% O₂, 10% CO₂, 85% N₂） |

| 培养时间 | 增菌24-48小时；分离24-48小时 |

| 关键特征 | 弧形/螺旋形、42°C生长良好、马尿酸钠水解阳性 |

生物学特性与形态

ATCC 33291为革兰阴性弧形或螺旋形杆菌（0.2-0.5 × 0.5-5 μm），在暗视野显微镜下可观察到特征性的"开瓶器样"运动（corkscrew motility）。该运动由两端的单极鞭毛驱动，是弯曲菌区别于其他革兰阴性杆菌的重要形态学特征。

在CCDA（无碳头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂）上，42°C微需氧培养48小时后，菌落灰白色、扁平、有光泽、边缘不规则，直径1-2mm。菌落形态可能因培养时间和培养基批次不同而有所变化——有时呈蔓延生长，有时呈水滴状。

微需氧与嗜热特性

空肠弯曲菌的两个关键生长特性：

微需氧需求： 该菌在大气氧浓度（21%）和完全无氧条件下均不能生长，最适O₂浓度为5%左右。这一特性要求使用专用微需氧培养系统。

嗜热特性： 空肠弯曲菌在42°C下生长优于37°C（最适温度42°C），在25°C以下不生长。42°C培养温度本身具有选择性——可抑制大多数肠道杂菌的生长。

培养条件与操作要点

微需氧培养系统

这是空肠弯曲菌检测的核心技术环节。常用方法：

微需氧产气包法： 将培养皿放入密封罐中，使用商业化微需氧产气包（如CampyGen、CampyPak）。产气包在密封后约30分钟内建立5% O₂/10% CO₂/85% N₂的微需氧环境。笔者建议在罐内放置O₂和CO₂指示卡，确认气氛条件达标。

三气混合培养箱： 通过质量流量控制器精确调节O₂、CO₂和N₂的比例，自动维持微需氧环境。适用于大批量培养，但设备投资较高。

真空-充气法： 先将密封罐抽真空（去除大部分O₂），再充入混合气体（5% O₂ + 10% CO₂ + 85% N₂）。这种方法需要真空泵和气体混合装置。

Bolton肉汤增菌

Bolton肉汤是ISO 10272和GB 4789.9推荐的增菌培养基。配方特点：

• 基础：营养丰富的肉汤基础

• 添加剂：头孢哌酮（10 mg/L）、万古霉素（10 mg/L）、甲氧苄啶（10 mg/L）、多粘菌素B（2500 IU/L）、放线菌酮（50 mg/L）

• 添加5%裂解马血（提供生长因子）

操作：取25g样品加入225mL Bolton肉汤中，均质后37°C微需氧预培养4-6小时（促进受损菌复苏），然后42°C微需氧继续培养24-44小时。

CCDA/mCCDA分离培养

增菌液划线接种于CCDA或mCCDA（改良CCDA）琼脂，42°C微需氧培养24-48小时。mCCDA在CCDA基础上添加了头孢哌酮和两性霉素B，选择性更强。

在各标准中的应用

中国国标（GB）中的应用

GB 4789.9-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》： ATCC 33291作为阳性质控菌株，用于Bolton肉汤增菌和CCDA分离培养的方法验证。

ISO标准中的应用

ISO 10272-1:2017（食品中空肠弯曲菌检测-水平法）： 推荐ATCC 33291作为阳性质控菌株。

ISO 10272-2:2017（弯曲菌计数法）： 同样推荐使用该菌株进行计数培养基的验证。

其他标准

EU Regulation 2073/2005（欧盟食品微生物标准）： 对禽肉胴体中的弯曲菌设定了限量标准，ATCC 33291用于相关检测方法的验证。

食品检测中的实际应用

禽肉检测： 空肠弯曲菌在活禽肠道中的携带率可达60-80%，屠宰后禽肉胴体的污染率通常在20-60%。检测重点覆盖：生鲜鸡肉、生鲜火鸡肉、禽肉制品。

原料乳检测： 生乳中的弯曲菌污染通常来源于患乳房炎的奶牛，在生乳和未经巴氏杀菌的乳制品中需要监控。

水样检测： 饮用水和娱乐用水中弯曲菌的监测也是食品安全链条的重要环节。

菌种保藏与管理

空肠弯曲菌的保藏管理需要特别注意：该菌对环境压力（干燥、氧气、温度波动）极为敏感，在室温暴露于空气中会迅速失活。

冻干保存： 首选方法，ATCC冻干管可长期保存。

-80°C甘油冻存： 在Bolton肉汤中加入15-20%甘油，-80°C可保存6-12个月。

工作菌种： 在含血琼脂上42°C微需氧培养后，2-8°C保存不超过1周。该菌在非微需氧条件下存活时间极短，工作菌种管应密封保存。

传代次数控制在3-5代以内。高传代后菌体形态可能从弧形变为球形（coccoid form），活力和致病性均显著下降。

安全注意事项

BSL-2级别。空肠弯曲菌的感染剂量极低（据估计500-800 CFU即可致病），可通过摄入和气溶胶途径感染。操作须在II级生物安全柜内进行，严格避免产生气溶胶。

实验室获得性弯曲菌感染并不罕见，操作者应加强个人防护意识。

常见问题与工程师建议

Q1：微需氧产气包用完后罐内O₂浓度偏高怎么办？

如果微需氧产气包过期或密封不严，可能导致O₂浓度偏高（>8%），抑制弯曲菌生长。建议：使用新鲜的产气包、检查密封罐的O型圈是否老化、在罐内放置O₂指示卡实时监控。如果条件允许，三气混合培养箱是更可靠的选择。

Q2：CCDA平板上杂菌过多，如何改善？

CCDA的选择性在禽肉样品中可能不够强。可以尝试：1）使用mCCDA（改良CCDA，选择性更强）；2）在增菌阶段增加预处理步骤（如微需氧条件下42°C增菌48小时而非24小时）；3）添加活性炭到培养基中（可吸附增菌液中的残留抗生素）。

Q3：如何区分空肠弯曲菌和大肠弯曲菌？

两者在CCDA上的菌落形态相似。关键区分试验：马尿酸钠水解试验——空肠弯曲菌阳性（产生甘氨酸，与茚三酮反应呈紫色），大肠弯曲菌阴性。此外，空肠弯曲菌对头孢噻吩耐药而大肠弯曲菌敏感。MALDI-TOF MS可快速准确地区分两者。

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免责声明： 本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO国际标准、GB国家标准及FDA BAM等公开权威资料，仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准，并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。

关键词标签: ATCC 33291, 空肠弯曲菌, Campylobacter jejuni, 微需氧培养, Bolton肉汤, CCDA, GB 4789.9, ISO 10272, 禽肉检测