丙酮酸脱羧酶（PDC）检测试剂盒（微量法 100T/96S） 新品

丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定试剂盒说明书

                                                   微量法 100T/96S 

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪

粗酶液提取：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μl提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

PDC测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃水浴中预热30min。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μl蒸馏水、20μl混合试剂、140μl试剂二和20μl试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μl上清液、20μl混合试剂、140μl试剂二和20μl试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。

注意：空白管只需测定一次。

PDC活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(Cpr×V样) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min /g 鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(W×V样÷V样总) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (nmol/min /ml) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷V样÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V总：反应体系总体积，0.2ml=2×10-4 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.02ml；V样总：提取液体积，1 ml；Cpr：蛋白浓度（mg/ml），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(Cpr×V样) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min /g 鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(W×V样÷V样总) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (nmol/min /ml) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷V样÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V总：反应体系总体积，0.2ml=2×10-4 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.02ml；V样总：提取液体积，1 ml；Cpr：蛋白浓度（mg/ml），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。