丙酮酸脱羧酶（PDC）测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

丙酮酸脱羧酶（PDC，EC4.1.1.1）是糖酵解途径关键酶，主要功能包括：能量代谢：催化丙酮酸脱羧生成乙醛，是乙醇发酵途径的核心步骤胁迫响应：参与植物低氧胁迫、干旱胁迫的代谢调控工业应用：用于酿酒、生物燃料生产等发酵工艺的优化病理研究：与神经退行性疾病、代谢紊乱等疾病相关

测定原理

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛和CO₂，通过偶联NADH氧化反应监测酶活性： 丙酮酸→PDC乙醛+CO2丙酮酸PDC乙醛+CO2 乙醛+NADH+H+→乙醇脱氢酶乙醇+NAD+乙醛+NADH+H+乙醇脱氢酶乙醇+NAD+ NADH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度下降速率计算PDC活性。

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）

台式高速离心机（≥12000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细菌/酵母样本）

必备耗材

1mL石英比色皿（光径1cm）/96孔紫外板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

液氮（用于样本速冻）

样本前处理方法

植物组织样本取新鲜叶片/根茎组织，用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定

酵母/细菌样本收集对数生长期酵母（OD600=0.6-0.8）或细菌（OD600=0.5-0.7）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次加入1mL预冷提取液重悬，冰浴超声破碎（功率20%，超声3s/间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测

昆虫组织样本取新鲜昆虫组织（如脂肪体、中肠），用生理盐水冲洗按1:5比例加入提取液，冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

测定操作步骤

紫外分光光度法操作

试剂配制：

试剂一：提取液，直接使用

试剂二：辅酶溶液，使用前用蒸馏水稀释5倍

试剂三：底物溶液，现配现用，-20℃可保存1周

预温育：

取比色皿，依次加入：提取液920μL + 稀释后辅酶溶液20μL + 样本40μL

37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A1

反应启动：

加入底物溶液20μL，立即混匀，开始计时

分别记录1min（A2）、2min（A3）时的吸光度值

计算ΔA：ΔA = (A1 - A2) + (A2 - A3)

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：提取液92μL + 稀释后辅酶溶液2μL + 样本4μL37℃预温育5min，加入底物溶液2μL立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟转化1μmol丙酮酸的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟转化1μmol丙酮酸的酶量

U/10⁶cell：每100万个细胞每分钟转化1μmol丙酮酸的酶量

计算公式

PDC活性(U/g鲜重)=ΔA×V反总×V样总ε×d×W×T×V样测PDC活性(U/g鲜重)=ε×d×W×T×V样测ΔA×V反总×V样总

ΔA：1min内吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

W：组织鲜重（g）

T：反应时间（1min）

V样测：测定时加入样本体积（0.04mL）

简化公式

组织样本：PDC（U/g鲜重）= 63.5 × ΔA ÷ W

蛋白样本：PDC（U/mgprot）= 63.5 × ΔA ÷ Cpr （Cpr为蛋白浓度，mg/mL）

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合

试剂使用：

辅酶溶液对光敏感，需避光保存

底物溶液需现配现用，避免分解

试剂配制后需检查pH值（7.5±0.2）

测定过程：

反应温度严格控制在30-37℃，不同样本最适温度不同

若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算

质量控制：

每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照（已知活性PDC酶）

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确

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