谷氨酸脱羧酶（GAD）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

谷氨酸脱羧酶（GAD）是催化L-谷氨酸脱羧生成抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的限速酶，其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测糖尿病、癫痫、帕金森病等神经系统疾病疾病监测：评估神经系统损伤程度和疾病进展农业研究：提高植物抗逆性和品质生物学研究：了解神经递质代谢机制和细胞功能医药开发：开发抗癫痫、抗焦虑药物

测定原理

可见分光光度法

GAD催化谷氨酸产生GABA，利用Berthelot反应测定GABA含量，从而测定GAD活性。反应式如下： L-谷氨酸→GADγ-氨基丁酸+CO2L-谷氨酸GADγ-氨基丁酸+CO2

ELISA法

采用双抗体夹心原理，以特异性抗GAD抗体作为捕获抗体，酶标记抗GAD抗体作为检测抗体，通过底物显色反应测定GAD含量。

速率法

GAD催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸，同时消耗NADH，通过监测340nm波长下NADH吸光度下降速率计算GAD活性。反应式如下： L-谷氨酸+NADH+H+→GADγ-氨基丁酸+NAD++CO2L-谷氨酸+NADH+H+GADγ-氨基丁酸+NAD++CO2

试剂盒组成

可见分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体30mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH8.0），用于提取样本中的GAD

试剂一 液体6mL×1瓶 含L-谷氨酸溶液，GAD反应底物

试剂二 液体5mL×1瓶 含Berthelot试剂，用于检测GABA含量

试剂三 液体10mL×1瓶 含标准品（GAD），用于建立标准曲线

试剂四 液体20mL×1瓶 含稳定剂，保持GAD活性

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗GAD抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗GAD抗体

标准品 液体1mL×2瓶 含0U/L、20U/L、50U/L、100U/L、200U/L、400U/L GAD标准品

样本稀释液 液体20mL×1瓶 含PBS缓冲液（pH7.4），用于稀释样本

洗涤液 液体20mL×1瓶 含0.05% Tween-20的PBS缓冲液，用于洗板

底物液 液体10mL×1瓶 含TMB底物液，用于显色反应

终止液 液体10mL×1瓶 含2mol/L H₂SO₄溶液，用于终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度法：可见光分光光度计（640nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、洗板机

速率法：紫外分光光度计（340nm检测通道）、1cm石英比色皿

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

血清/血浆样本采集：空腹采集静脉血，分离血清/血浆保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1个月溶血处理：若样本溶血，需重新采集样本，避免红细胞中GAD干扰测定

组织/细胞样本组织处理：称取0.1g组织，加入1mL生理盐水，冰浴匀浆细胞处理：收集1×10⁶细胞，加入1mL生理盐水，冰浴超声波破碎离心：10000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测

尿液/脑脊液样本采集：收集晨尿或随机尿，脑脊液样本需无菌采集稀释：用生理盐水稀释10-20倍后测定保存：4℃可保存24h，-20℃可保存1个月

测定操作步骤

可见分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至640nm，蒸馏水调零标准曲线绘制：

取标准品用蒸馏水稀释成0、20、40、80、120、200U/L系列浓度

取100μL标准溶液于EP管中，加入100μL试剂一和100μL试剂二，混匀

37℃水浴反应30min，取出冷却至室温，加入100μL试剂三，混匀

室温放置10min，测定640nm波长下的吸光度，绘制标准曲线样品测定：

取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度

根据标准曲线计算样品中GAD活性

ELISA法操作包被板准备：从试剂盒中取出包被板，平衡至室温样本与标准品加样：分别加入50μL样本和标准品至对应孔中，37℃孵育30min洗板：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次浸泡3min酶标抗体加样：加入50μL酶标抗体至每孔，37℃孵育30min洗板：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤5次，每次浸泡3min底物显色：加入50μL底物液至每孔，37℃避光孵育15min终止反应：加入50μL终止液至每孔，立即读取450nm波长下的吸光度

速率法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零样本测定：

在石英比色皿中加入200μL样本、200μL试剂一和100μL试剂二，混匀

记录340nm处初始吸光值A₁和2min后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂

空白对照：以蒸馏水代替样本，同样处理标准曲线绘制：将标准品稀释成0、20、40、80、120、200U/L系列浓度，同样处理

结果计算方法

单位定义

U/L：每升样本中每分钟催化生成1μmol GABA的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化生成1μmol GABA的酶量

U/mgprot：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol GABA的酶量

可见分光光度法计算公式

GAD活性(U/L)=(A测定−A空白)×C标(A标准−A空白)GAD活性(U/L)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×C标

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（U/L）

ELISA法计算公式

GAD含量(mg/L)=(A测定−A空白)×C标(A标准−A空白)GAD含量(mg/L)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×C标

A测定：样本孔吸光度值

A空白：空白孔吸光度值

A标准：标准孔吸光度值

C标：标准品浓度（mg/L）

速率法计算公式

GAD活性(U/L)=ΔA×V总×106ε×d×t×V样GAD活性(U/L)=ε×d×t×V样ΔA×V总×106

ΔA：340nm处吸光度下降速率

V总：反应体系总体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

t：反应时间（min）

V样：样本体积（L）

性能指标

指标 可见分光光度法 ELISA法 速率法

线性范围 0~200U/L 0~480U/L 0~200U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1mU/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110% 95%~105%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤3.0% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤5.0% CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免GAD失活；-20℃可保存3个月

血清样本需避免溶血和脂血，避免干扰测定结果

组织样本需洗净表面血液，避免污染

试剂使用：

酶试剂需避免反复冻融，用后立即放回-20℃保存

显色剂需临用前配制，避光保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应温度需严格控制在37℃，反应时间30分钟

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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