脯氨酸脱氢酶（ProDH）测试盒 新品

商品属性

基础信息

ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶，降低其活性对调节植物渗透平衡、清除自由基、保护细胞结构意义重大。

检测原理

ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过电子传递链还原特定显色剂，通过测定600nm处吸光度的下降速率，代表ProDH活性。主要有两种检测体系：吩嗪二甲酯硫酸（PMS）-2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）体系：脱下的氢通过PMS传递还原DCPIP，DCPIP在600nm处有特征吸收峰，吸光度下降速率代表酶活性。异硫氰酸甲酯体系：利用异硫氰酸甲酯检测脱氢反应，600nm处吸光度变化反映酶活性高低。

试剂盒组成

试剂名称 规格 保存条件 使用说明

提取液一 液体60mL×1瓶 4℃保存 直接使用

提取液二 液体0.6mL×1支 4℃保存 直接使用

试剂一 液体40mL×1瓶 4℃保存 直接使用

试剂二 粉剂×1瓶 4℃保存 临用前加入5mL蒸馏水充分溶解，用不完的4℃保存

试剂三 粉剂×1瓶 4℃保存 临用前加入4mL蒸馏水充分溶解，用不完的4℃保存

试剂四 粉剂×1瓶 -20℃保存 临用前加入10mL蒸馏水充分溶解，用不完的可分装-20℃保存，避免反复冻融

自备实验用品及仪器

仪器：天平、低温离心机、可见分光光度计（或酶标仪，微量法使用）、1mL玻璃比色皿（或微量玻璃比色皿/96孔板，微量法使用）、匀浆器/研钵、可调式移液器、冰浴设备

试剂：丙酮、蒸馏水

操作步骤

（一）样本处理（以植物组织为例）称取约0.1g新鲜植物组织，加入1mL提取液一和10μL提取液二，冰浴匀浆匀浆液在4℃下，1500g离心15min，取上清液向上清液中加入一滴试剂一，涡旋混匀，冰浴放置30min4℃下，16000g离心20min，取上清液即为ProDH粗酶液，置于冰上待测

（二）工作液配制

临用前根据用量按照**试剂一（V）:试剂二（V）:试剂三（V）=1.6(mL):0.2(mL):0.15(mL)**的比例充分混匀，现配现用，用多少配多少。

（三）测定步骤

可见分光光度法

分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零

取1mL工作液加入比色皿中，再加入0.1mL待测酶液，迅速混匀，立即记录吸光度A₁

准确反应1min后，记录吸光度A₂，计算ΔA=A₁-A₂

微量法

酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零

在96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂，混匀，记录初始吸光值A₁

准确反应2min后，记录吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂

酶活性计算

（一）可见分光光度法

酶活性（U/g鲜重）=ΔA×V总×N/(ε×d×W×t)

ΔA：吸光度变化值

V总：反应体系总体积（mL）

N：稀释倍数

ε：摩尔吸光系数（DCPIP的ε=21.0×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光程（cm）

W：样本鲜重（g）

t：反应时间（min）

（二）微量法

不同试剂盒的计算公式略有差异，以下为常见公式：按蛋白浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位 酶活力(nmol/min/mgprot)=1808×ΔA÷Cpr

ΔA：吸光度变化值

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）按样本鲜重计算 单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位 酶活力(nmol/min/g鲜重)=365×ΔA÷W

ΔA：吸光度变化值

W：样本鲜重（g）

注意事项

实验前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，若样本吸光值不在测量范围内，建议稀释或增加样本量试剂应按照说明书要求保存，避免反复冻融实验过程中严格控制反应时间和温度，确保结果准确性所有操作均需在冰浴条件下进行，避免酶失活微量法对操作要求更高，需保证移液器精准校准

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