猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒(CSFV/PRRSV-M)核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法)

产品介绍：

猪瘟/高致病性猪蓝耳病病毒（CSFV/PRRSV-M）核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）是一种用于兽医临床诊断的分子生物学工具。该试剂盒能够在一个反应体系中同时检测并区分两种对养猪业危害严重的病毒：猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV-M）。

这两种病毒常引起猪群高热、繁殖障碍和呼吸系统疾病，且临床症状相似，易发生混合感染。本试剂盒通过双重荧光PCR技术，实现了对这两种重大疫病的高效、精准鉴别诊断。

该试剂盒基于双重实时荧光定量PCR（Dual-color qPCR）技术，采用TaqMan探针法原理，通过一步法RT-qPCR（反转录-定量PCR）同步检测两种病毒的RNA。

检测靶标：

猪瘟病毒 (CSFV)：针对其基因组中的保守区域设计特异性引物和探针，通常是5'非翻译区 (5'UTR) 或 NS5B基因。CSFV可引起猪瘟，导致高热、出血性病变和高死亡率。

高致病性猪蓝耳病病毒 (PRRSV-M)：针对其特征性变异区域设计特异性引物和探针，通常是Nsp2基因的缺失变异区或ORF7基因。PRRSV-M株可引起高致病性蓝耳病，导致母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。

荧光标记与通道：

FAM通道：通常用于检测CSFV，探针标记FAM荧光基团。

HEX/VIC通道：通常用于检测PRRSV-M，探针标记HEX或VIC荧光基团。

部分试剂盒还会设置内参基因（如猪RNase P基因，标记Cy5通道），用于监控样本采集、核酸提取及PCR扩增是否正常，防止假阴性。

核心优势：

双重检测，高效鉴别：一次实验即可同时检出CSFV和PRRSV-M，有效区分单一感染与混合感染，避免漏诊，指导精准防控。

高特异性：引物和探针经过精心设计，只扩增目标病毒，与猪圆环病毒（PCV）、伪狂犬病毒（PRV）等其他猪源常见病原无交叉反应。

高灵敏度：检测灵敏度极高，最低检出限可达到 1×10³ copies/mL，能够有效检出样本中微量的病毒核酸。

快速便捷：采用一步法RT-qPCR，无需RNA提取后更换酶，减少操作步骤和污染风险；全程检测时间约1-2小时。

市面上的试剂盒规格通常为 50次/盒 (50T)。

规格与成分

市面上的试剂盒规格通常为 50次/盒 (50T)。

一个完整的试剂盒通常包含以下组分：

组分名称  规格/描述  作用

qRT-PCR预混液 (Master Mix)  含逆转录酶、Taq酶、dNTPs、缓冲液  提供RT-PCR反应所需的核心酶和底物

双重引物/探针混合物  含FAM标记的CSFV探针 + HEX标记的PRRSV-M探针  特异性识别并扩增目标病毒序列

阳性对照 (Positive Control)  含CSFV和PRRSV-M目标基因片段的质粒混合物  用于验证试剂盒的有效性

阴性对照 (Negative Control)  无核酸酶水  用于监控反应体系是否存在污染

使用方法

标准操作流程遵循分子生物学实验规范：

样本采集与处理：

采集样本：采集猪的全血（抗凝）、血清、脾脏、淋巴结、肺脏等组织。

处理方法：组织样本需进行匀浆处理，全血或血清样本可直接提取RNA。

RNA提取：

使用商业化的病毒RNA提取试剂盒（如磁珠法或离心柱法）提取样本中的总RNA。

反应体系配置：

按说明书比例混合预混液、引物探针混合液。

分装至PCR反应管，每管加入提取的RNA模板（通常为5-10μL）。

上机扩增：

仪器设置：在ABI 7500、Roche LightCycler 480等荧光定量PCR仪上运行。

反应程序（参考）：

逆转录：42-50℃ 10-30分钟

预变性：95℃ 3-10分钟

循环阶段（40-45个循环）：95℃ 15秒 → 55-60℃ 30-60秒（采集荧光）

结果判读：

CSFV阳性：FAM通道出现典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 ≤ 阈值（如35-40）。

PRRSV-M阳性：HEX/VIC通道出现典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 ≤ 阈值。

双重阳性：FAM和HEX两个通道均出现阳性扩增曲线。

阴性：两个通道均无扩增曲线或Ct值为“Undet”（未检测到）。

注意事项

保存条件：试剂盒需在 -20℃避光 条件下保存，有效期通常为12个月。避免反复冻融，尤其是酶制剂和阳性对照。

适用范围：该产品仅供兽医诊断、科研或工业检测使用，不可用于临床医疗。

生物安全：猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒均为重要动物疫病病原，处理阳性样本时需在生物安全二级（BSL-2）实验室进行，穿戴防护装备，防止感染。

防污染：PCR实验极易受污染，必须严格分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区），使用带滤芯的枪头，防止扩增产物污染导致假阳性。

方法优势

相较于传统的细菌培养法（耗时长、生物安全要求极高）或血清学检测（窗口期长），荧光PCR法具有显著优势：

高特异性： 通过针对鼠疫杆菌特异性基因（如caf1、pla）设计的引物和探针，能够精准识别目标菌，有效区分近缘菌种（如假结核耶尔森氏菌），避免假阳性。

高灵敏度： 检测灵敏度极高（部分产品最低检测限可达1-10 CFU/mL或10-100拷贝/毫升），有助于在感染早期、菌血症含量较低或样本经过抗生素治疗后做出准确判断。

快速高效： 从样本DNA提取到出结果通常在数小时内完成，远快于传统培养法（通常需要数天），适合在突发公共卫生事件中对大量样本进行快速筛查。

安全便捷： 采用闭管检测模式，扩增后无需开盖处理，大大降低了扩增产物污染和操作人员接触高致病性病原体的风险。部分试剂盒采用预混冻干技术，便于试剂的储存和运输。

公司正在出售的产品：

质量控制与常见问题：

污染防控：

分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区），使用带滤芯吸头。

实验后用10%次氯酸或紫外灯清洁工作台。

假阴性处理：

检查样本抑制物（如使用内标基因）。

试剂保存：

-20℃避光保存，避免反复冻融。