γ谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

γ谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL，EC6.3.2.2）是谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，主要功能包括：谷胱甘肽合成：催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，为GSH合成提供前体氧化还原调节：GSH是细胞内最重要的抗氧化剂，GCL活性直接影响细胞内GSH含量和氧化还原状态疾病关联：GCL活性异常与多种疾病相关，如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等应激响应：GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等

测定原理

在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，同时ATP去磷酸化产生无机磷分子： Glu+Cys+ATP→GCLγ-Glu-Cys+ADP+PiGlu+Cys+ATPGCLγ-Glu-Cys+ADP+Pi 通过测定无机磷毫摩尔数，即可计算出GCL活性。

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度计/酶标仪（660nm检测通道）

台式高速离心机（≥8000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）

必备耗材

1mL玻璃比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

浓硫酸（用于无机磷测定）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定

细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释

测定操作步骤

分光光度法操作

试剂准备：

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存

试剂二：液体1mL×1支，-20℃保存

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加500μL蒸馏水溶解

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存，用时加500μL蒸馏水溶解

检测工作液：试剂一1.0mL + 试剂二50μL + 试剂三50μL + 试剂四50μL，现配现用

检测工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中预热10min以上

预温育：

分光光度计预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零

反应启动：

空白管：取比色皿，依次加入工作液900μL + 提取液100μL

混匀，在660nm波长下记录10min（A1）时的吸光度值

测定管：取比色皿，依次加入工作液900μL + 样本100μL

混匀，在660nm波长下记录10min（A2）时的吸光度值

计算ΔA：ΔA = A2 - A1

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液90μL + 样本10μL37℃预温育10min，加入样本后立即混匀测定660nm处吸光度值计算样本吸光度与空白吸光度的差值（ΔA）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol无机磷的酶量

U/mL：每mL样本每分钟生成1μmol无机磷的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1μmol无机磷的酶量

计算公式

GCL活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总×1000ε×d×Cpr×V样测×TGCL活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总×1000

ΔA：10min内吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：无机磷摩尔消光系数（1.8×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样测：测定时加入样本体积（0.1mL）

T：反应时间（10min）

简化公式

组织样本：GCL（U/g鲜重）= 5.56 × ΔA ÷ W

液体样本：GCL（U/mL）= 5.56 × ΔA

蛋白样本：GCL（U/mgprot）= 5.56 × ΔA ÷ Cpr

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触

试剂使用：

ATP溶液对光敏感，配制后需避光保存

检测工作液需现配现用，避免ATP降解

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）

若ΔA值大于0.5，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算

质量控制：

每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定

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