甲基柠檬酸合酶(MCS）测试盒

甲基柠檬酸合酶(MCS）测试盒

测定意义与原理

测定意义

MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸，这一过程对维持细胞能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢具有重要作用：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经系统疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解线粒体功能、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选线粒体靶向药物，用于治疗线粒体疾病和神经退行性疾病

测定原理

MCS催化丙酰CoA与草酰乙酸反应生成甲基柠檬酰辅酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸光值。通过测定412nm吸光值的上升速率，计算MCS活性。反应式如下： 丙酰CoA+草酰乙酸→MCS甲基柠檬酰辅酶A丙酰CoA+草酰乙酸MCS甲基柠檬酰辅酶A 甲基柠檬酰辅酶A+DTNB→甲基柠檬酸+TNB甲基柠檬酰辅酶A+DTNB→甲基柠檬酸+TNB

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 液体100mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的MCS

试剂二 液体100mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的MCS

试剂三 液体1.5mL×1支 含激活剂，用于提高MCS活性

试剂四 液体30mL×1瓶 含缓冲液，用于配制工作液

试剂五 粉剂×1瓶 含显色剂，用于检测TNB

试剂六 粉剂×1支 含酶激活剂，用于提高MCS活性

标准品 1mL×1支 含MCS标准液，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/比色法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

微量法：酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

动植物组织样本取样：准确称取0.1g组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干匀浆：加入1mL试剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆低速离心：600g，4℃离心5min，弃沉淀，保留上清液高速离心：11000g，4℃离心10min，弃上清液，沉淀即为线粒体线粒体破碎：加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）检测：裂解液用于MCS酶活性测定

细胞样本收集：收集500万细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：加入1mL试剂一和10μL试剂三，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清/血浆样本可直接检测；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

测定操作步骤仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零工作液配制：临用前在试剂五中加入1mL无水乙醇和22mL试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融样本测定：

取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL样本、220μL工作液和10μL试剂六，混匀

记录412nm处20秒时的初始吸光值A1和2分20秒后的吸光值A2，计算ΔA=A2–A1标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度

同样处理，测定2min内吸光值变化，绘制标准曲线

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol TNB的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟生成1nmol TNB的酶量

U/L：每升样本每分钟生成1nmol TNB的酶量

计算公式

MCS活性(U/mg prot)=ΔA×V总ε×d×Cpr×T×V样×109MCS活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×T×V样ΔA×V总×109

ΔA：样本管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

ε：TNB摩尔消光系数（13.6×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

T：反应时间（min）

V样：样本体积（L）

性能指标

指标 分光光度法/比色法/微量法

线性范围 0~50U/L

最低检测限 ≤0.1U/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤2.3%

批间精密度 CV≤5.34%

稳定性 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免MCS失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免线粒体过度破碎

试剂使用：

试剂六需临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存

工作液需现配现用，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入试剂后需充分混匀，确保反应完全

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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