甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒

甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒说明书

                                     分光光度法10管/9样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒定意义：                           

MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体2mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体0.2mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入320μL无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入320μL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂七：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入320μL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g，4℃离心5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。

⑤ 在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。

甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

3、样本测定

将上述试剂按顺序加入1 mL玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在412nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和反应2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

MCS活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V样÷V样总）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.4444×ΔA

V反总：反应体系总体积，9×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。