急性肝胰腺坏死病（AHPND/EMS）病原核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 新品

 产品介绍：

该试剂盒主要用于检测对虾养殖过程中由特定弧菌（主要是副溶血性弧菌）引起的急性肝胰腺坏死病，该病俗称“偷死病”，死亡率极高。

本试剂盒采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，能够快速、精准地检测病原菌特有的毒力基因（如*pirvp*基因）。

 �� 产品核心信息

检测对象：致急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）或其他携带AHPND致病质粒的弧菌。

检测原理：TaqMan荧光探针法。针对AHPND病原特有的毒力基因片段设计特异性引物和FAM标记的探针。

适用仪器：ABI 7500、LightCycler 480、CFX96、Bio-Rad C1000等实时荧光定量PCR仪。

检测样本：对虾肝胰腺组织、鳃、养殖水体、虾苗等。

�� 试剂盒组成（以48T为例）

组分名称  规格  作用说明

qPCR Mix  1.0 mL x 1管  含dNTPs、Mg²⁺、热启动Taq酶、反应缓冲液

Primers & Probe  100 μL x 1管  预混引物和FAM标记的探针

阳性对照 (PC)  50 μL x 1管  含目标基因片段的质粒或菌液DNA

阴性对照 (NC)  50 μL x 1管  无DNA酶水（ddH₂O）

ROX Reference Dye  50 μL x 1管  荧光校正染料（视仪器型号选配）

�� 操作流程详解

1. 样本处理与DNA提取

组织样本：取对虾肝胰腺或鳃组织约20 mg，加入180 μL缓冲液GA（或生理盐水），使用组织研磨器匀浆。

DNA提取：

取200 μL匀浆液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（如离心柱法或磁珠法）进行提取。

洗脱步骤：加入50-100 μL洗脱缓冲液（EB）洗脱DNA。

提取的DNA建议立即使用，或置于-20℃保存（避免反复冻融）。

2. 反应体系配制（冰上操作）

总体系：20 μL（可根据仪器要求调整）。

配制表：

试剂  体积

2x qPCR Mix  10 μL

Primers & Probe  1 μL

模板DNA  2 μL（或5 μL，视浓度而定）

ddH₂O  补足至20 μL

3. PCR扩增程序

两步法扩增程序：

步骤  温度  时间  循环数

预变性  95℃  5分钟  1 cycle

PCR扩增  95℃  15秒  40 cycles

60℃  60秒（采集荧光）

�� 结果判读标准

1. 质控标准（必须满足）

阴性对照 (NC)：FAM通道无扩增曲线（Ct值未定义或≥40）。

阳性对照 (PC)：FAM通道出现典型的"S"型扩增曲线，且Ct值 ≤ 30。

2. 样本判定

阳性 (+)：FAM通道出现明显的"S"型扩增曲线，且 Ct值 ≤ 35。表明样本中含有AHPND病原菌。

可疑 (±)：Ct值在 35-40 之间。建议对该样本进行复检，或重新提取DNA检测。若复测Ct值 < 35则判为阳性。

阴性 (-)：FAM通道无扩增曲线，或Ct值 ≥ 40。

⚠️ 注意事项

防污染：qPCR检测灵敏度极高，极易受气溶胶污染。必须严格分区操作（试剂准备区、样本制备区、扩增区），实验服、手套、移液器需专用。

加样规范：加样时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，防止蒸发导致结果异常。

对照设置：每次检测必须设置阴阳性对照，若对照结果不符合预期，本次实验结果视为无效。

临床意义：检测结果需结合对虾的临床症状（如肝胰腺萎缩、空肠、摄食量下降等）进行综合判断。

生物安全：阳性对照含有病原基因片段，操作时应视为具有潜在生物危害性，废弃物需高压灭菌处理。

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注意事项

防污染操作

需在试剂准备区、样本处理区、扩增区独立操作，使用带滤芯吸头及专用实验服。

阳性对照管理

浓度高达1×10⁸拷贝/μL，需单独存放并避免污染其他试剂。

局限性

仅限科研使用，不可用于临床诊断；

环境样本中可能存在PCR抑制剂，需设置内参对照。