辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒，分光光度法，微量法 新品

辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。

自备仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

NADP+和NADPH的提取：

1、 血清（浆）中NADP+和NADPH的提取

NADP+的提取：按照血清（浆）体积（ml）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照血清（浆）体积（ml）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中NADP+和NADPH的提取：

NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、 细胞或细菌中NADP+和NADPH的提取：

NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：酸性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：碱性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

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