辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物体内重要的氧化还原辅酶，主要功能包括：能量代谢：参与磷酸戊糖途径（PPP）、生物合成反应（如脂肪酸、核苷酸、胆固醇合成）抗氧化防御：NADPH是谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶的辅酶，维持细胞氧化还原稳态信号调控：NADPH/NADP+比值是细胞氧化还原状态的重要指标，影响基因表达、细胞增殖和分化病理关联：NADP(H)代谢异常与糖尿病、肿瘤、神经退行性疾病等相关

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH：NADPH含量测定：NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，在570nm下检测吸光值NADP+含量测定：利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）还原NADP+为NADPH，再通过MTT还原法检测总NADP(H)计算：总NADP(H) = NADPH含量 + NADP+含量氧化还原比值计算：NADPH/NADP+比值 = NADPH含量 / NADP+含量

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度计/酶标仪（具备570nm检测通道）

台式高速离心机（最大转速≥10000rpm）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本处理）

必备耗材

1mL玻璃比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性吸头（无菌无酶）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（用于样本稀释）

液氮（用于样本速冻保存）

样本前处理方法

组织样本（动植物）新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.05-0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）转移至离心管，10000rpm 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释后测定（建议稀释倍数1-10倍）

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率30%，超声5s，间隔10s，重复20次）10000rpm 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理

测定操作步骤

分光光度法流程

试剂准备：

从4℃取出试剂盒，室温平衡20min

试剂工作液：按比例混合试剂A、B、C，现配现用

NADP+标准溶液：用蒸馏水稀释至0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mmol/L

NADPH测定：

取比色皿，依次加入：提取液900μL + NADPH提取液50μL + 样本50μL

37℃预温育5min，加入MTT溶液20μL立即混匀

室温避光反应20min，记录570nm处吸光度A1

NADP+测定：

另取比色皿，依次加入：提取液900μL + NADP+提取液50μL + 样本50μL

37℃预温育5min，加入G6PDH溶液20μL立即混匀

室温反应10min后，加入MTT溶液20μL混匀，避光反应20min，记录570nm处吸光度A2

标准曲线绘制：

以NADP+标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线

计算回归方程：y = kx + b（y为吸光度，x为NADP+浓度）

微量法（酶标仪）流程96孔板每孔加入：提取液90μL + NADPH/NADP+提取液5μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入MTT/G6PDH溶液2μL立即混匀酶标仪设置动力学模式，570nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度变化值（ΔA），代入标准曲线计算NADP(H)含量

含量计算方法

标准曲线法

NADPH/NADP+含量(μmol/g鲜重)=(ΔA样本−b)×V样总×稀释倍数k×W×V样测NADPH/NADP+含量(μmol/g鲜重)=k×W×V样测(ΔA样本−b)×V样总×稀释倍数

ΔA样本：样本吸光度变化值（A样本 - A空白）

k：标准曲线斜率

b：标准曲线截距

V样总：样本提取液总体积（mL）

V样测：测定时加入的样本体积（0.05mL）

W：组织鲜重（g）

直接计算法

NADPH/NADP+含量(μmol/L)=ΔA×V反总×106ε×d×V样NADPH/NADP+含量(μmol/L)=ε×d×V样ΔA×V反总×106

ΔA：吸光度变化值（A2 - A1）

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

ε：甲瓒摩尔消光系数（约1.5×10^4 L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

V样：测定时加入的样本体积（0.05mL）

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免NADPH氧化；密封冷藏可保存24h

细胞/组织样本需避免反复冻融，以免NADP(H)降解

环境样本需过滤去除杂质，避免干扰吸光度测定

试剂使用：

MTT溶液对光敏感，配制后需避光保存，24小时内用完

试剂需按比例混合，现配现用；不同批号试剂禁止混用

6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）需-20℃分装保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃，避免温度影响酶活性

若吸光度值超出标准曲线范围，需调整稀释倍数重新测定

每个样本需设置平行实验，结果取平均值

质量控制：

每次实验需设置空白对照（蒸馏水替代样本）和质控样本

若结果偏差较大，需检查试剂是否失效或样本处理是否正确

若样本NADP(H)含量较低，可延长反应时间至60min或增加取样量

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