产品描述
本试剂盒是为特异性检测人GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase) 基因mRNA表达水平而优化的荧光定量PCR (qPCR) 检测系统。采用SYBR Green I 染料法进行实时荧光检测。试剂盒包含经过优化的预混液、特异性引物、阳性对照及必要的辅助试剂。
产品名称 | 人GAPDH基因染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Human GAPDH Gene Dye-based Quantitative Real-time PCR Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR2703 |
核心优势
高特异性： 预先设计并验证的高特异性人GAPDH引物对，有效扩增目标片段，减少引物二聚体和非特异扩增。
高灵敏度： 可检测低至数个拷贝的靶标分子。
高扩增效率： 优化的反应体系确保扩增效率接近100%，保证定量准确性。
宽动态范围： 可跨越多个数量级进行准确定量 (>6 logs)。
操作简便： 预混的Master Mix包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I染料及稳定剂，只需加入模板、引物和水即可配制反应体系。
稳定可靠： 严格质控，确保批间稳定性。
兼容性好： 适用于多种主流实时荧光定量PCR仪。
应用领域
基因表达分析（mRNA水平）中作为内参基因 (Housekeeping Gene)，用于目标基因相对定量的标准化。
细胞或组织样本中人GAPDH表达水平的绝对或相对定量。
RNA样本质量评估。
实验操作流程
1. 实验前准备
将所有试剂（除预混液外）置于冰上融化，完全溶解后短暂离心使液体沉至管底。
Master Mix (含染料) 需避光保存，融化后请置于冰上或冷暗处。 轻弹或涡旋混匀，避免剧烈振荡产生气泡，短暂离心。
设计好实验布局（标准曲线孔、待测样品孔、阳性对照孔、阴性对照孔），记录孔位。
准备好工作液（可选）：将10μM的GAPDH Forward和Reverse Primer等体积混合，配制成5μM的Primer Mix工作液。
2. 反应体系配制 (以单管20μL体系为例)
推荐反应体系：
| 组分 | 体积 (μL) | 终浓度/含量 |
| 2x SYBR Green qPCR Master Mix | 10 | 1x |
| GAPDH Forward Primer (10μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| GAPDH Reverse Primer (10μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| Nuclease-Free Water | Variable | - |
| 模板 (cDNA) | 2-4 | (建议体积) |
| 总体积 | 20 | |
模板体积： 通常加入2-4 μL cDNA作为模板。具体加入量需根据cDNA浓度和PCR仪器灵敏度优化。建议进行预实验确定最佳模板量（避免Ct值过小<15或过大>30）。标准曲线模板需稀释。
Water体积： 通过添加Nuclease-Free Water将终体积补足至20 μL。例如，加2μL模板时需加7.2μL水（10 + 0.4 + 0.4 + 7.2 + 2 = 20）。
引物添加： 使用Primer Mix工作液时，加入0.8 μL (5μM) 即可代替0.4μL F和0.4μL R。
配制方法：
在冰上或冷板上，按计算好的体积依次向反应管/孔中加入Nuclease-Free Water、Master Mix、引物。
轻柔混匀（可用移液器吹打或轻弹），避免产生气泡。
最后加入模板cDNA (换新吸头)，再次轻柔混匀（或用移液器吸打几次）。
短暂离心，使液体集中于管底/孔底。
若使用96孔板，需盖好光学盖膜或封板膜。
对照设置：
阳性对照 (Positive Control)： 用阳性对照DNA代替模板cDNA（通常用1-2μL的1000拷贝/μL原液或适当稀释液）。用于验证试剂盒和反应体系是否正常工作。
无模板对照 (No Template Control, NTC)： 用等体积的Nuclease-Free Water代替模板cDNA。用于检测体系是否存在污染或引物二聚体。
标准曲线 (Standard Curve, 可选)： 如需进行绝对定量，需用阳性对照DNA进行系列稀释（如10^6, 10^5, 10^4, 10^3, 10^2拷贝/μL），每个稀释度做3个复孔。用于建立拷贝数与Ct值的关系。
3. PCR扩增程序
将反应管/板放入实时荧光定量PCR仪中。
设置以下推荐程序（具体参数可能需要根据仪器型号和Master Mix特性微调）：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 采集荧光信号 |
| 1. 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 否 |
| 2. 循环扩增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 否 |
| | 60℃ | 30 sec | | 是 (SYBR通道) |
| 3. 熔解曲线 | 95℃ | 15 sec | 1 | 否 |
| | 60℃ | 1 min | | 否 |
| | 95℃ | 15 sec | | 是 (连续采集) |
| | 60℃ | 15 sec | | 否 |
预期结果
扩增曲线： 阳性对照和样品孔应呈现典型的S型扩增曲线，指数期明显。
Ct值： 在cDNA质量良好且模板量适中的情况下，GAPDH的Ct值通常在 15-25个循环 之间（具体取决于样本类型、RNA量、cDNA投入量）。不同样本间Ct值应相对稳定（变异小），这是其作为良好内参基因的标志。阳性对照Ct值应与其稀释倍数对应。NTC Ct值应 >35 或无Ct值。
熔解曲线： GAPDH扩增产物应呈现单一的、尖锐的熔解峰。Tm值应一致。
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