MICRORNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)

microRNA荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green荧光染料)采用特异性的上下游引物对反转录所得microRNA的cDNA产物进行定量检测。不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法，Biorab采用双向特异性扩增引物（原理如图1），从而极大提高了miRNA的检测特异性，其可以区分极高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增（图2，3所示）。该miRNA荧光定量PCR试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种，试剂盒编号为MTAXXXXX，每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒，可下载SYBR Green miRNA qPCR kit列表查询。如果您研究的miRNA分子不在我们的列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计。该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化，确保扩增效率和特异性。





产品组成：

储存：请置于-20℃，可保存2年；避免反复冻融。

操作方法：

1．按以下组分配制反转录反应液(反转录反应需购买我司的一步法microRNA反转录试剂盒)：

2．在PCR 仪上按以下条件进行反应:
  37℃——————60min
  95℃——————5分钟
3．获得 cDNA 产物后使用microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。根据机型选择步骤A或B配制反应体系：
步骤A：需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：ABI PRISM 7900HT、7300、7500 Real-TimePCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。
步骤B：无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的RealTime PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。

4．进行 Real-Time PCR 反应，通常采用两步法，程序如下：

注意：使用该方法通常可以准确检测到>0.01fM的microRNA 分子，过多的循环数会造成精确性降低。推荐的循环数为 30 个，在检测极低样品浓度时可将循环数调整到 35 个。

5．扩增结果分析和数据处理：
反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线和融解曲线。


6．标准品的使用
  该试剂盒配备的标准品为单链 DNA 分子，其与目标microRNA 分子反转录产物完全相同，因此可直接用于 PCR扩增，从而检测 PCR 体系的可靠性。其浓度为 1pM，通常20μl PCR 体系中加入1μl，可获得 Ct 值在15 左右的数据。除此外，可以使用TE Buffer 进行稀释，最低可稀释到0.01fM，用于标准曲线扩增或绝对定量试验。

常用内参miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)