人恶性黑色素瘤细胞;A375-LUC-EGFP

                                                          人恶性黑色素瘤细胞;A375-LUC-EGFP
产品信息：

1. 细胞基本特性与背景

亲本来源： 源自人恶性黑色素瘤细胞 A375（该细胞系源自一位54岁女性患者的皮肤黑色素瘤组织）。

标记基因：

LUC： 荧光素酶，用于生物发光检测。

EGFP： 增强型绿色荧光蛋白，在蓝光激发下发出绿色荧光。

Puro： 嘌呤霉素抗性基因，用于筛选和维持质粒稳定性。

细胞类型： 肿瘤细胞（恶性黑色素瘤细胞）。

生长特性： 贴壁生长。

细胞形态： 上皮细胞样。

关键特征： 该细胞系BRAF V600E突变阳性，常用于靶向治疗及免疫治疗研究。

应用领域： 仅限科研使用，主要用于黑色素瘤机制研究、抗肿瘤药物筛选、活体成像及细胞示踪。

培养条件与完全培养基配置

A375-LUC-EGFP 细胞的培养条件通常沿用 A375 细胞的培养条件。

基础培养基： DMEM（高糖）。

添加成分：

胎牛血清 (FBS)： 10%。

双抗 (Penicillin-Streptomycin)： 1%。

嘌呤霉素 (Puromycin)： 1-10 μg/mL（用于维持筛选压力，防止荧光素酶和EGFP基因丢失。具体浓度请参考供应商说明书，通常维持在2-5 μg/mL即可）。

培养环境：

温度： 37℃。

气相： 5% CO，95% 空气。

湿度： 饱和湿度。

3. 详细培养操作指南

细胞复苏

快速解冻： 将冻存管从液氮中取出，迅速放入 37℃水浴 中，轻轻摇晃，使其在 1 分钟内完全融化。

稀释离心： 用酒精消毒管壁，将细胞悬液缓慢加入含 4-6 mL 预热完全培养基的离心管中混匀。1000 rpm 离心 3-5 分钟。

重悬接种： 弃去上清，加入含嘌呤霉素的完全培养基重悬细胞，接种到 T25 培养瓶中。

静置培养： 次日观察细胞贴壁情况，建议更换新鲜培养基以去除残留的 DMSO。

细胞传代（当细胞密度达 80%-90% 时）

弃液洗涤： 弃去旧培养基，用不含钙镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

消化： 加入 0.25% 胰蛋白酶（Trypsin-EDTA，约 1-2 mL），放入 37℃ 培养箱消化 1-2 分钟。

注意：A375 细胞贴壁较牢，消化时间可能比普通细胞稍长，需在显微镜下观察。

终止消化： 待细胞间隙变大、变圆脱落时，加入含血清的培养基终止消化。

离心分瓶： 将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm 离心 5 分钟。弃上清，加入新鲜完全培养基重悬，按 1:2 至 1:3 的比例分装传代。

细胞冻存

收集： 按传代步骤收集处于对数生长期的细胞。

冻存液： 推荐使用 90% FBS + 10% DMSO，或者专用的无血清冻存液。

程序降温： 将冻存管放入程序降温盒，置于 -80℃冰箱 过夜，第二天转入 液氮罐 长期保存。

4. 关键注意事项（必读）

荧光稳定性维护（关键）：

为了维持 LUC 和 EGFP 的稳定表达，建议在平时的培养基中维持 低浓度的嘌呤霉素筛选。

如果发现荧光强度减弱，可以进行高浓度嘌呤霉素的短期筛选以富集阳性细胞。

贴壁较牢：

A375 细胞属于贴壁非常牢固的细胞。传代时需要耐心等待胰酶发挥作用，切勿强行吹打，以免损伤细胞膜。

生长速度：

该细胞生长速度属于中等，倍增时间约为 24 小时左右。传代后通常需要 2-3 天才能长满。

生物安全等级：

属于 BSL-2 细胞，操作时需在生物安全柜中进行，并穿戴适当的防护装备。

总结

A375-LUC-EGFP 是研究黑色素瘤及进行活体成像的“双保险”工具。培养它的核心在于维持抗生素筛选压力（以保证双荧光稳定）和耐心消化（因为贴壁较牢）。只要掌握好这两点，它就能为你提供稳定的发光信号和清晰的荧光图像，助你的科研一臂之力。

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细胞具体特点如下：

环境与营养：需无菌环境、精确的温度（36-37℃）和pH（7.2-7.4），动物细胞常需血清，植物细胞需激素。

生长方式：贴壁细胞需表面附着，悬浮细胞自由漂浮，半贴壁半悬浮兼具两者特性。

传代与密度：贴壁细胞需胰酶消化传代，悬浮细胞直接分瓶；密度达80%-90%时需传代，避免营养枯竭与代谢抑制。

敏感性：对剪切应力、污染、温度变化敏感，需定期更换培养液清除代谢物。

应用与局限：便于活细胞观察与实验控制，但体外环境与体内存在差异，长期传代可能导致遗传不稳定与去分化。