NPTII基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

该试剂盒采用 TaqMan 荧光探针法。

检测靶标：特异性扩增 NPTII 基因的保守序列。

荧光标记：

FAM 通道：标记针对 NPTII 基因的特异性探针。

内标（IC）：部分试剂盒会引入内源性内标（如植物 18S rRNA 基因，通常标记为 VIC/HEX 通道），用于监测试剂盒是否失效以及样本中是否存在 PCR 抑制物，防止假阴性。

定量/定性：通过 Ct 值（循环阈值）判断样本中是否含有 NPTII 基因，并可依据标准曲线进行定量分析（如检测含量是否超过标识阈值 0.1%）。

 2. 试剂盒组成

以常见的 48 测试/盒规格为例，主要包含以下组分：

组分名称 描述 保存条件

PCR 反应液 含 dNTPs、Mg2、缓冲液、热启动 Taq 酶 -20℃ 避光保存

引物/探针混合液 针对 NPTII 基因特异性设计 -20℃ 避光保存

阳性对照 (PG) 含 NPTII 基因片段的质粒或 DNA -20℃ 保存

阴性对照 (NG) 无菌水或缓冲液 4℃ 或 -20℃ 保存

 3. 适用范围与背景

应用领域：食品安全检测、进出口检验检疫、饲料安全检测、科研实验。

检测样本：大豆、玉米、油菜籽、水稻等植物源性食品及其加工制品。

检出限：通常灵敏度极高，最低检出限可达 0.1%（即能检测出含 0.1% 转基因成分的混合样品）。

特异性：与其他非转基因植物基因组无交叉反应。

 4. 操作流程简述

样本前处理：取适量样品（如大豆粉），使用植物基因组 DNA 提取试剂盒提取总 DNA。

体系配置：在冰盒上操作，将反应液、引物探针、DNA 模板混合。

上机扩增：

仪器设置：选择 FAM 通道（Reporter Dye），淬灭基团通常为 TAMRA 或 None。

反应程序（典型参数）：

预变性：95℃ 10 min

扩增循环（40 cycles）：95℃ 15 sec → 60℃ 1 min（收集荧光）

结果判读：

阳性（+）：FAM 通道扩增曲线呈典型的“S”型，且 Ct 值 ≤ 36（或阈值线穿过扩增曲线）。

阴性（-）：无扩增曲线，或 Ct 值 ≥ 40，曲线呈直线。

无效实验：若阳性对照未扩增或阴性对照出现扩增，则本次实验无效。

 5. 关键注意事项

严格分区：PCR 检测对污染极其敏感，实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、扩增区），严禁物品交叉使用。

防污染：

操作时必须穿戴一次性手套、口罩和实验服。

严禁在扩增区打开扩增后的 PCR 管盖，以防气溶胶污染环境。

避光保存：反应液中的荧光染料对光敏感，配制反应体系时应尽量避光操作。

避免反复冻融：试剂盒组分对反复冻融敏感，建议按单次使用量分装保存，避免反复冻融超过 3 次。

 总结

该试剂盒是转基因检测中筛查标记基因的重要工具。如果你是检测机构人员，请务必严格遵循说明书中的 Ct 值判定标准 和 实验室分区制度，以确保检测结果的准确性和可靠性。