百日咳杆菌(BP)检测试剂盒(荧光PCR法)

检测目标

靶基因：

IS481序列（百日咳杆菌特异性插入重复序列，检测限1拷贝/μL）

ptxA基因（编码百日咳毒素启动子，区分野生株与疫苗株）

覆盖变异株：包括当前流行的ptxA1（毒性增强型）和ptxA3（疫苗逃逸型）。

方法原理

双重荧光PCR：

IS481-FAM探针（筛查） + ptxA-HEX探针（分型），内标（Cy5标记人RNase P基因）监控采样质量。

采用抗黏液聚合酶，适配鼻咽拭子（NP）等高黏度样本。

适用样本

临床：鼻咽拭子（首选）、痰液（成人患者）、支气管肺泡灌洗液（重症）

流行病学：疫苗接种后突破性感染病例的病原溯源

二、试剂盒组分与操作流程

1. 核心组分

组分 功能说明

RT-PCR预混液 含逆转录酶、热启动Taq酶、dUTP/UNG防污染系统

探针引物混合液 IS481-FAM/ptxA-HEX探针，内标（Cy5）

阳性对照 灭活BP Tohama I株（ATCC BAA-589）与ptxA1突变株混合RNA

核酸释放剂 含溶菌酶和Triton X-100，支持拭子直接裂解（免提取）

2. 操作步骤（以鼻咽拭子为例）

样本处理：拭子头浸入500μL释放剂，涡旋10秒，95℃加热5分钟灭活。

PCR扩增（20μL体系）：

50℃ 15min（RT）→ 95℃ 3min → [95℃ 10s → 60℃ 30s]×40 cycles

结果判读：

IS481（FAM）Ct≤35 + ptxA（HEX）Ct≤38 → 野生株感染。

三、性能与质控

1. 关键参数

指标 性能标准 验证依据

灵敏度 100%检出（≥102 CFU/mL） WHO BP核酸标准品

特异性 不与副百日咳杆菌、支气管败血鲍特菌交叉 200例临床样本验证

抗干扰性 耐受30%鼻腔分泌物或抗生素（如阿奇霉素） 模拟临床样本测试

2. 质控要求

每批次检测需包含：

弱阳性对照（50 CFU/mL，监控检测下限）

阴性对照（生理盐水）

内标（Cy5 Ct值28-32）

四、注意事项

采样时效性

卡他期（发病1-2周）鼻咽拭子检出率＞90%，恢复期推荐血清学补充检测。

生物安全

BP属BSL-2病原体，拭子需置于密闭运输管中（UN3373认证包装）。

局限性

疫苗接种7天内可能假阳性（死菌DNA残留），需结合培养验证。

五、应用场景

临床诊断：

婴幼儿阵发性咳嗽的病原确诊（区别于呼吸道合胞病毒/腺病毒感染）。

公卫监测：

疫苗接种覆盖率评估（检测ptxA3逃逸株流行趋势）。

院感防控：

新生儿病房医护人员带菌筛查