病毒性神经坏死病毒（VNNV）RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

病毒性神经坏死病毒（VNNV）RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

试剂简介：

检测目标：特异性检测病毒性神经坏死病毒（Viral Nervous Necrosis Virus, VNNV），一种严重危害海水鱼（如石斑鱼、鲈鱼）的RNA病毒，引致幼鱼中枢神经系统坏死、旋转游动等高死亡率症状。

方法原理：基于荧光定量RT-PCR，靶向VNNV的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）基因保守区，通过FAM标记探针实时检测，搭配内参基因（如鱼类β-actin，HEX通道）监控样本质量。

适用样本：鱼脑/视网膜组织（首选）、鱼苗、水体滤膜（病毒富集）。

检测流程

样本处理

组织样本：取20 mg脑组织液氮研磨，加入TRIzol裂解后离心。

水体样本：0.22 μm滤膜过滤，PBS洗脱浓缩病毒颗粒。

RNA提取

推荐磁珠法（如RNeasy Mini Kit），提取后立即逆转录（避免RNA降解）。

RT-PCR扩增

反应体系：

引物探针：RdRP-F/R（FAM）、内参（HEX）。

循环程序：50℃ 15min（逆转录）→ 95℃ 3min →（95℃ 15s → 60℃ 45s）×45循环。

结果判读

阳性：Ct≤35（FAM），且内参Ct≤30（鱼类样本）。

可疑：35<Ct<38，建议重复检测或测序确认。

3. 性能参数

指标  参数要求

灵敏度  ≤50 copies/反应

特异性  不与鱼类弹状病毒（SVCV）交叉

检出限  10^2 copies/mg脑组织

抗干扰性  耐受10%鱼体黏液或水体腐殖酸

4. 注意事项

假阴性风险：

病毒在无症状鱼体中可能呈潜伏感染，建议多点采样。

水体样本需超滤浓缩（10倍以上）以提高灵敏度。

生物安全：操作需在BSL-2实验室进行，避免气溶胶扩散。

质控要求：每批次含阴性对照（健康鱼组织RNA）、阳性对照（VNNV体外转录RNA）。

5. 应用场景

水产养殖：

鱼苗进口检疫（如石斑鱼苗VNNV筛查）。

发病鱼群快速诊断（尤其幼鱼突发性旋转症状）。

生态监测：野生海水鱼种群病毒携带率调查。

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