草鱼出血病II型病毒（GCRV II）RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

草鱼出血病II型病毒（GCRV II）RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

试剂简介：

一、试剂盒核心信息

检测目标与流行病学特征

草鱼出血病II型病毒（Grass Carp Reovirus II, GCRV II）

分类学地位：呼肠孤病毒科（Reoviridae），水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus）

基因特征：

靶向VP6基因（编码主要结构蛋白，基因型特异性保守区）

辅助靶标S10基因（用于区分GCRV I/II/III亚型）

流行特点：

主要危害1龄以下草鱼苗种，水温25-30℃时暴发

典型症状：肌肉出血、鳃盖充血、肠壁透明化

技术原理

双重荧光PCR：

FAM通道：GCRV II特异性VP6基因探针

HEX通道：通用型S10基因探针（内参）

灵敏度：5拷贝/μL（优于传统RT-PCR 100倍）

二、试剂盒组成与样本处理

核心组分（25测试/盒）

组分  技术参数

核酸提取试剂  含鱼类组织专用裂解缓冲液（可有效破除鱼体粘多糖抑制）

RT-PCR预混液  含HotStart Taq酶+MMLV逆转录酶，支持一步法RT-PCR

引物探针组  VP6-FAM(5'-3')：CGT GAC ATC CTG TTC AAG/HEX-S10探针

质控系统  阳性对照（GCRV II-HN20株RNA）、阴性对照（DEPC水）、内标（斑马鱼β-actin）

样本采集规范

最佳样本类型：

病鱼：肝胰脏（病毒载量最高）、脾脏、肾脏

环境样本：养殖水体（需0.45μm滤膜浓缩100mL）

保存与运输：

立即检测：4℃保存≤24小时

长期保存：-80℃（避免反复冻融＞3次）

运输：干冰或RNA稳定剂（如RNAlater）

三、标准化检测流程

操作步骤（全程约2.5小时）

核酸提取

组织样本：取50mg加1mL裂解液，匀浆后70℃孵育10分钟

水体样本：离心浓缩后磁珠法提取（回收率＞85%）

RT-PCR反应

反应体系（20μL）：

预混液10μL + 引物探针2μL + 模板3μL + DEPC水5μL

扩增程序：

50℃ 15min（逆转录）→ 95℃ 3min → 45×[95℃ 10sec → 60℃ 45sec]（双通道采集）

结果判读标准

检测指标  Ct值范围

GCRV II(FAM)  ≤35

35-38  可疑（建议重复检测）

≥40  阴性

内标(HEX)  25-30

四、应用指南与局限性

临床应用场景

早期预警：投苗前筛查，检出限可达102 copies/g

疫苗评价：免疫后14天监测病毒载量下降趋势

注意事项

采样时机：发病初期（3天内）检出率最高（＞95%）

变异株监测：需定期比对GenBank最新毒株序列（如2024年GCRV II-JX变异株）

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