花生过敏原Ara H2(Arah2)ELISA试剂盒

花生过敏原Ara H2(Arah2)ELISA试剂盒

简介 

花生过敏原Ara H2是花生中最主要的致敏蛋白之一，占花生蛋白总量的约10%，其分子量为约17.20 kDa，等电点为5.2。Ara H2是花生过敏的主要致敏原，能够引发严重的食物过敏反应，甚至导致过敏性休克。研究表明，90%以上的花生过敏患者血清中可以检测到对Ara H2的特异性IgE抗体。Ara H2与其他花生过敏原（如Ara H1和Ara H3）相比，具有更高的致敏性和敏感性。例如，Ara H2检测的阳性率显著高于其他过敏原，且其特异性IgE检测在诊断花生过敏中具有重要价值。此外，Ara H2能够激活更多的树突状细胞，并在较低浓度下诱导更强的免疫反应。

本试剂盒Arah2免疫测定是一种三步法固相夹心ELISA，用于测量细胞培养上清液、血清和血浆中的Arah2。试剂盒包含大肠杆菌表达重组Arah2和针对重组蛋白产生的抗体。使用天然Arah2获得的结果显示出与使用重组标准品获得的标准曲线平行的线性曲线。这些结果表明，该试剂盒可用于测定天然Arah2的相对质量值。

检测原理 

试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物Arah2，孵育清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色液后，若样本中有待测物则显蓝色，则加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中Arah2的浓度。

双抗体夹心模式

按操作顺序形成抗体夹心结构后，加入TMB底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液变为黄色后进行吸光度值测定。

 检测实验的局限性

1. 试剂盒的使用期限不得超过试剂盒标签上的有效期。不要将试剂与其他批次或来源的试剂混合使用或替换使用。

2. 如果样品产生的值高于最高标准，则用测定稀释剂进一步稀释样品，并重复测定。稀释剂、操作人员、移液技术、洗涤技术、培养时间或温度以及试剂盒使用年限的任何变化都可能导致结合变化。

3. 样本采集、处理和存储的变化可能会导致样本值的差异。

4. 本试剂盒实验设计消除了不同样品中可能潜在的干扰因素的影响，但并不能涵盖所有潜在影响因素。不能排除存在其他干扰的可能性。

操作要点 

1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。

2. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。

3. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。

4. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。
5. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；

2. 移液器及枪头；

3. 蒸馏水或去离子水；

4. 100-1000mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；

6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀释标准品和样品的试管。

注意事项

1. 此试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。

2. 该试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

3. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

4. 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品。处理后彻底洗手。

试剂准备

使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）

洗涤液/稀释液配制：试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从640ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至32ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的32ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将32ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为：32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。

 抗体工作液配置：

使用前10分钟，用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量配置。

酶结合物工作液配置：

使用前10分钟，用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。

备注 ：如待测样本中Arah2浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数 (建议：将待测样本用样品稀释液最低稀释1倍，在正式实验之前做预实验，以确定具体稀释倍数) ；标准品母液、100×生物素化抗体溶液及100×SA-HRP溶液请根据实验所需酶标板孔数吸取一定量配置工作液，剩余溶液应放回2-8℃储存。

实验步骤

所有标准品、样品建议复孔检测

1. 酶标板准备：1.确定试验所需要的孔数，取下未使用的酶标条放回装有干燥剂的铝箔袋。

2. 样本孵育：2.每孔分别加入100μL不同浓度的标准品以及预处理过的待测样品，盖上封板胶纸，37℃避光反应1.5h。孵育结束后，每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液，轻轻晃动30秒，甩干并在纸上拍干，以这种方式清洗3次。

3. 抗体孵育：3.每孔加入100μL生物素化抗体工作液，轻轻混匀，盖上封板胶纸，37℃避光反应1h。孵育结束后，重复步骤2中的清洗方式清洗4次。
4. 酶标孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，盖上封板胶纸，37℃避光反应30分钟，清洗4次，拍干。
5. 底物显色：5.每孔首先加入50μL显色液A，随后加入50μL显色液B，轻轻混匀，盖上封板胶纸，37℃避光反应15分钟。（根据样品和对照抗体的颜色，自行控制显色时间）

6. 终止反应：待显色反应结束后，每孔加入50μL终止液，轻轻混匀，5分钟内用预热完成的酶标仪在450nm处测吸光值。
实验步骤汇总

1. 加标准品及样品，37℃避光反应1.5h，洗涤3次。

2. 加生物素化抗体，37℃避光反应1h，洗涤4次。

3. 加酶结合物，37℃避光反应30分钟，洗涤4次。

4. 加显色液，37℃避光反应15分钟。

5. 加终止液，在5分钟内读数。

精密度

操作内精密度：（测定中的精密度）在一块平板上对两个已知浓度的样品进行20次测试，以评估测定内精密性。

操作间精度：（测定间精度）在10个单独的测定中测试两个已知浓度的样品，以评估测定间精度。至少有三名技术员进行了实验。

灵敏度 

经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.25ng/mL。

线性关系

分别在选取的4份健康血清、血浆和细胞培养上清中加入高浓度Arah2，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。

特异性
该试剂盒测定可识别天然和重组Arah2
本试剂盒由上海酶联生物公司提供，花生过敏原Ara H2(Arah2)ELISA试剂盒相关的实验曲线数据请下载本产品说明书。