致病性大肠杆菌(EPEC)检测试剂盒(荧光PCR法)

致病性大肠杆菌(EPEC)检测试剂盒(荧光PCR法)

简介：

致病性大肠杆菌（EPEC）检测试剂盒（荧光PCR法）是一种用于体外定性检测食品、临床粪便样本或环境样本中肠道致病性大肠杆菌的分子诊断产品。

其核心原理是实时荧光定量PCR技术。该技术通过特异性引物和荧光探针，对EPEC的特有致病基因进行高灵敏度、高特异性的扩增和检测，是现代食源性病原体和腹泻病原诊断的常用方法。

二、 检测目标：致病性大肠杆菌（EPEC）详解说明：

在了解检测方法前，必须先明确检测对象：

病原：肠道致病性大肠杆菌，是致泻性大肠杆菌的一种重要类型。

致病特点：EPEC主要通过一种称为“黏附与抹平”的机制致病。它会紧密地黏附在宿主肠上皮细胞表面，破坏微绒毛结构（导致微绒毛萎缩），从而引起吸收障碍和严重腹泻。

主要危害：

主要感染婴幼儿，是发展中国家婴幼儿腹泻的重要病原之一。

临床症状包括水样便、发热、呕吐和脱水，严重时可危及生命。

关键毒力基因：EPEC的典型特征是由eae基因（编码紧密素Intimin）和bfpA基因（编码束状菌毛主要结构蛋白）共同决定。因此，PCR检测通常以这两个基因作为靶标。

典型EPEC (tEPEC)：同时携带 eae 和 bfpA 基因。

非典型EPEC (aEPEC)：只携带 eae 基因，而不携带 bfpA 基因。

三、 检测原理（荧光PCR法）：

该试剂盒的检测过程基于以下步骤：

核酸提取：从处理的样本（如增菌后的肉汤、粪便悬液）中提取细菌的DNA。

荧光PCR扩增与检测：

特异性引物：试剂盒中含有针对EPEC特异性基因（如 eae 和/或 bfpA）设计的引物。这些引物能精准识别并结合到目标基因序列上。

荧光探针：试剂盒中含有一条或多条带有荧光报告基团和淬灭基团的特异性探针。

实时监测：在PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶的水解酶活性会切割探针，使报告基团与淬灭基团分离，从而发出荧光信号。

信号积累与判读：每完成一次扩增循环，就有一份荧光信号被释放。如果样本中含有EPEC，其DNA经过指数级扩增，荧光信号会逐渐增强，最终超过设定的阈值。仪器实时监测这一过程，并记录每个反应管荧光信号达到阈值时所经历的循环数（Ct值）。

四、 试剂盒主要组成：

一个典型的EPEC荧光PCR检测试剂盒通常包含：

PCR反应液：含有缓冲液、dNTPs、Mg2?等。

热启动Taq DNA聚合酶。

EPEC特异性引物和探针混合液（可能针对单靶标 eae 或多靶标 eae 和 bfpA）。

阳性对照：含有EPEC目标基因片段的质粒DNA，用于验证实验有效性。

阴性对照：无核酸酶水，用于排除污染。

内标（可选）：用于监控从DNA提取到PCR扩增的全过程，防止因抑制物导致的假阴性结果。

五、 操作流程：

样本前处理与增菌：按规定处理样本，并进行选择性增菌，以增加目标菌数量。

DNA提取：从增菌液或直接从样本中提取细菌基因组DNA。

试剂配制：在冰上按比例混合PCR反应所需的各种组分。

加样：将提取的DNA模板、阳性对照、阴性对照分别加入配好的反应液中。

上机检测：将反应管放入荧光PCR仪，设置好反应程序（通常包括：预变性 → 40-45个循环的变性、退火、延伸）。

结果分析：程序结束后，仪器软件会自动分析荧光曲线，并给出Ct值。

六、 结果判读：

阳性：检测通道出现典型的S型扩增曲线，且Ct值小于或等于说明书规定的临界值（如Ct ≤ 35）。表明样本中含有EPEC的特异性核酸。

阴性：无扩增曲线或Ct值大于临界值。表明样本中未检测到EPEC特异性核酸，或菌量低于检测下限。

无效：阳性对照无扩增曲线或阴性对照出现扩增曲线，表明实验过程存在问题，结果无效，需重新检测。

注意：根据靶标基因的不同，可以进一步区分典型EPEC和非典型EPEC。

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