大鼠Vitammin Delisa试剂盒

检测原理

基于竞争性酶联免疫吸附试验（Competitive ELISA）。样本或标准品中的维生素D与生物素标记的维生素D竞争结合预包被在板上的抗体。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素后，通过TMB显色反应检测信号强度，吸光度（OD值）与维生素D含量成反比。

检测指标

目标物：大鼠血清、血浆、细胞培养上清液中的总25-羟基维生素D（25(OH)D）

检测形式：定量检测

单位：ng/mL 或 nmol/L（需参照标准曲线）

样本要求

样本类型：大鼠血清、血浆（EDTA/肝素抗凝）、组织匀浆液、细胞上清

样本处理：

血清/血浆：离心去除杂质，避免反复冻融（≤3次）

组织：用PBS匀浆后离心取上清

样本保存：-80°C ≤1个月（长期保存需分装）

试剂盒组成（以48孔板为例）

| 组分 | 规格 | 保存条件 |

| 预包被微孔板 | 96孔（可拆） | 2-8°C干燥 |

| 维生素D标准品 | 6-8浓度梯度 | -20°C避光 |

| 生物素标记检测抗体 | 1瓶（120μL） | -20°C |

| HRP-链霉亲和素 | 1瓶（120μL） | -20°C（避光） |

| TMB显色液 | 1瓶（10mL） | 2-8°C（避光） |

| 终止液 | 1瓶（10mL） | 室温 |

| 洗涤液（20×） | 1瓶（30mL） | 室温/2-8°C |

| 样本稀释液 | 1瓶（20mL） | 2-8°C |

操作步骤

配制试剂：用去离子水1:20稀释洗涤液（1×）。

标准品稀释：用样本稀释液梯度稀释标准品。

加样：

标准品孔：各浓度标准品50μL

样本孔：50μL待测样本

空白孔：样本稀释液50μL

加检测抗体：每孔加入50μL生物素标记抗体（不含空白孔）。

孵育：37°C避光孵育60分钟。

洗板：洗涤液洗板5次（每次浸泡30秒）。

加酶结合物：每孔加入100μL HRP-链霉亲和素。

二次孵育：37°C避光30分钟。

洗板：重复步骤6。

显色：每孔加90μL TMB，避光室温反应15分钟。

终止：每孔加50μL终止液（蓝色→黄色）。

检测：450nm波长读取OD值（需双波长校正：参考波长630nm）。

数据处理

计算空白孔平均OD值（若>0.1则操作有误）。

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，拟合4-Parameter Logistic（4PL）曲线。

根据样本OD值反算浓度（软件推荐：SoftMax Pro, GraphPad Prism）。

性能参数

| 参数 | 典型值 |

| 检测范围 | 1.56–100 ng/mL |

| 灵敏度 | ≤0.5 ng/mL |

| 批内精密度 | CV < 10% |

| 批间精密度 | CV < 15% |

| 回收率 | 85–115% |

| 特异性 | 不交叉反应维生素D代谢物 |

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