锦鲤疱疹病毒（KHV）检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 新品

商品属性：

用途： 本试剂盒用于定性检测锦鲤、鲤鱼等易感鱼类的组织（如鳃、肾、脾）、体表黏液或水体环境样本中的锦鲤疱疹病毒DNA。

检测意义： 锦鲤疱疹病毒病是一种由鲤疱疹病毒III型（CyHV-3）引起的高度传染性、致死性疾病，对锦鲤和普通鲤鱼养殖业造成毁灭性打击。

该试剂盒可用于KHV的早期快速诊断、引种检疫、疫情监测和无害化处理评估，是预防和控制该病的关键工具。 方法学： 实时荧光定量PCR（qPCR）技术，也称为TaqMan探针法。

二、 检测原理（核心技术）

PCR-荧光探针法是一种在PCR扩增过程中通过荧光信号实时监测靶标DNA扩增量的技术。其核心在于使用了特异性荧光探针。

DNA提取： 从样本中提取总DNA（包括可能存在的KHV DNA）。

PCR扩增与荧光信号产生： 将提取的DNA与试剂盒内的反应液混合，该反应液包含：

特异性引物： 一对针对KHV基因组高度保守区域（如TK基因、Sph基因等）设计的引物，用于特异性扩增一段DNA片段。

特异性荧光探针： 一条针对目标DNA序列设计的寡核苷酸探针，其两端分别标记了一个报告荧光基团（R） 和一个淬灭荧光基团（Q）。当探针完整时，由于荧光共振能量转移（FRET），Q基团会吸收R基团发出的荧光，导致检测不到荧光信号。

Taq DNA聚合酶： 具有5‘→3’聚合酶活性及3‘→5’外切核酸酶活性。

工作原理（每进行一次扩增循环）：

变性： 高温（通常95℃）使DNA双链解开成单链。

退火： 降温（通常55-60℃）使引物和荧光探针与模板DNA的特异性序列结合。

延伸： 升温至72℃，Taq酶沿模板合成新的DNA链。当合成到探针结合的位置时，Taq酶的3‘→5’外切酶活性会切断探针。

荧光释放： 探针被切断后，报告基团（R）和淬灭基团（Q）分离，FRET效应消失，R基团发出荧光信号。每扩增一条DNA链，就释放一个荧光信号。因此，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比。

实时检测： 实时荧光PCR仪在每个循环的退火或延伸结束时检测荧光强度。随着扩增循环数的增加，荧光信号强度呈指数增长。

阳性结果判定： 当荧光信号强度超过仪器软件设定的阈值（Threshold）时，所对应的PCR循环数称为Ct值。Ct值越小，代表起始模板中的病毒DNA含量越高。

三、 试剂盒组成（示例，具体以厂家说明书为准）

PCR反应液（Premix）： 通常为预混的2×浓度的溶液，含有缓冲液、dNTPs、Mg2?等。

酶混合物（Taq酶 Mix）： 包含热启动Taq DNA聚合酶，有时会与反应液预混在一起。

KHV荧光探针引物混合液： 含有针对KHV的特异性引物和荧光探针（通常探针标记FAM荧光基团）。

阳性对照（Positive Control）： 含有KHV特定基因片段的质粒DNA或灭活病毒，用于验证检测有效性并制作标准曲线。

阴性对照（Negative Control）： 无DNA酶的水，用于监控污染。

说明书

【用户需自备】

DNA提取试剂盒（用于鱼类组织或水体DNA提取）

?无核酸酶的水、PCR管/八联管、吸头

离心机、移液器、冰盒等。

四、 操作流程（简要步骤）

总流程：样本处理 → DNA提取 → 配制反应体系 → 上机扩增与检测 → 结果分析

样本处理：

组织样本： 取鳃、肾或脾等组织，称重后加入PBS研磨，离心取上清。

水体样本： 需先通过滤膜富集水中的病毒，再进行DNA提取。

病毒DNA提取：

使用商业化的基因组DNA提取试剂盒（柱式法或磁珠法），严格按照说明书操作，最终将DNA溶解于无核酸酶水中。

关键： 操作过程要防止DNA降解和交叉污染。

反应体系配制（以20μL体系为例，在冰上或超净工作台操作）：

取一个PCR管，依次加入：

2× PCR Premix 10.0 μL

KHV探针引物混合液 2.0 μL

提取的DNA模板 5.0 μL （或阳性/阴性对照）

无核酸酶水 补足至 20.0 μL

盖紧管盖，短暂离心混匀，立即放入荧光PCR仪中。

程序设置与运行：

五、 结果判读

结果在1.5-2小时内获得，判读依据是Ct值。

阳性： 荧光信号曲线呈典型的“S”型增长，并穿过阈值线。仪器软件会给出一个Ct值（通常Ct值 < 35-40，具体阈值范围参见说明书），并标记为“Positive”或“+”。Ct值越小，病毒载量越高。

阴性： 荧光曲线始终为平直的基线，未穿过阈值线，无Ct值或显示“Undetermined”。仪器软件标记为“Negative”或“-”。

无效：

阳性对照 结果为阴性或无Ct值 → 本次实验无效，需排查试剂、仪器或程序问题。

阴性对照 结果为阳性或有Ct值 → 提示存在严重污染，本次实验无效。

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