人D-乳酸（D-LA) ELISA试剂盒 YB74683Hu

人D-乳酸（D-LA) ELISA试剂盒

目 的： 本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本 中 D-乳酸（D-LA)含量。 

检测范围： 60μg/L -1600μg/L 

实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人D-乳 酸（D-LA)水平。用纯化的人 D-乳酸（D-LA)抗体包被 微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加 入 D-乳酸（D-LA)，再与 HRP 标记的 D-乳酸（D-LA) 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻 底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下 转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜 色的深浅和样品中的 D-乳酸（D-LA)呈正相关。用酶 标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标 准曲线计算样品中人 D-乳酸（D-LA)浓度。

样本处理及要求：

1. 血清： 室温血液自然凝固  10-20    分钟，离心20    分钟左右（2000-3000    转/分）   。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆： 应根据标本的要求选择  EDTA    或柠檬酸 钠作为抗凝剂，混合  10-20    分钟后，离心 20    分钟左右（ 2000-3000    转/分）   。仔细 收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液： 用无菌管收集 ，离心  20     分钟左右 （2000-3000    转/分）  。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清： 检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心  20    分钟左右（2000-3000转/分）   。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用  PBS （ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml    左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并 放出细胞内成份。离心  20    分钟左右（ 2000-3000 转/分）   。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形 成，应再次离心。

5. 组织标本： 切割标本后，称取重量。加入一定量 的  PBS ，PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持  2-8℃的温度。加入一定量的  PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心  20     分钟左右（ 2000-3000     转/仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含  NaN3     的样品，因  NaN3    抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。
   

操作步骤：

1.     标准品： 其起始浓度为 3200μg/L(贮液) 。再准备5 个稀释标准品的 EP  管，每个 EP  管中加入 150 μL 的 标 准 品 稀 释 液 ， 如 图 所 示 依 次 倍 比 稀 释 成 3200μg/L,1600μg/L,800μg/L,400μg/L,200μg/L,100μg/   L,标准品稀释液(0μg/L)直接作为空白孔。为保证实验 结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液

2. 加样： 分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）   、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液  40 μ l ，然后再加待测样品  10 μ l （样品最终稀释度为  5    倍）   。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育： 用封板膜封板后置  37℃温育30分钟。

4. 配液： 将  30    倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤： 小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置  30    秒后弃去，如此重复  5    次，拍干。

6. 加酶： 每孔加入酶标试剂

7. 温育： 操作同  3。

8. 洗涤： 操作同  5。

9. 显色： 每孔先加入显色剂A50 μ l ，再加入显色剂  B50 μ l ，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟.

10. 终止： 每孔加终止液  50 μ l，终止反应（此时 蓝色立转黄色)。

11. 测定： 以空白空调零，450nm    波长依序测量各孔的吸光度（OD值)。测定应在加终止液后  15    分钟以内进行。

注意事项：

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡  15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中 加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性， 以避免试验误差。一次加样时间最好控制在  5    分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍） 后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（ ×n ×5）  。

5.  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物请避光保存。

7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必 须以酶标仪读数为准.

8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物 处理。

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD    值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的  OD值由标准曲线查出相应的浓度； 再乘以稀释倍数； 或用标准物的浓度与  OD    值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的  OD    值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1. 样 品线性 回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。

2.批内与批见应分别小于  9%和  11%

3.保存条件及有效期：

a.试剂盒保存： 2-8℃。

b.有效期： 6个月