游离胆固醇含量测定试剂盒（分光光度法50T/48S）

游离胆固醇（free cholesterol, FC）含量测定试剂盒说明书

                                                  分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

 FC是构成细胞膜的主要成分，也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料。FC浓度可作为脂代谢的指标。

测定原理：

  FC氧化酶催化FC生成△4-胆甾烯酮和H2O2，过氧化物酶催化H2O2、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，在500nm有吸收峰，其颜色深浅与FC含量成正比。

组成：

标准品：液体1ml×1支，浓度为0.5 μ mol/ml，4℃保存

自备仪器和用品：

  可见分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿、异丙醇和蒸馏水。

FC的提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：先收集400-500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加1ml试剂一，超声波破碎1min（强度20％，超声2s，停1s），即FC待测液。

3．血清（浆）样品：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到500 nm，蒸馏水调零。

2.FC工作液的配制：临用前，吸取约0.8ml试剂二分别加入试剂三和试剂四瓶中，充分溶解后再全部转移回试剂二瓶中，充分混匀，FC工作液置于37℃水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 标准管：依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl FC标准液和900μl FC工作液，混匀，37℃静置3h后于500nm测定A标准管。

4. 测定管：依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl FC待测液和900μl FC工作液，混匀，37℃静置3h后于500nm测定A测定管。

5、空白管：依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl 试剂一和900μl FC工作液，混匀，37℃静置3h后于500nm测定A测定管。

注意：

1. 标准管和空白管只需测定一次。

2、若测定管产生白色浑浊，可以将待测液用异丙醇稀释2~5倍后测定，并在最后结果乘以相应倍数。

计算公式：

1. 血清（浆）中FC含量计算：

FC含量（μmol /dL）= C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）×100ml

=50×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）

C标准液：0.5μmol/ml；100 ml：1dL=100 ml。

2. 组织中FC含量计算：

(1)按样本蛋白浓度计算

FC含量（μmol / mg prot）= C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr

                       = 0.5×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

FC含量（μmol / g鲜重）= C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷W

                  = 0.5×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷W

C标准液：0.5μmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml

3. 细胞、细菌中FC含量计算：

FC含量（μmol /104 cell）= C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷细菌或细胞（104 cell /L）

=0.5×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷细菌或细胞（104 cell /L）

C标准液：0.5μmol/ml。

最低检出限为1nmol/ml。