游离胆固醇（FC）含量测试盒 新品

游离胆固醇（FC）含量测试盒

测定意义与原理

测定意义

游离胆固醇（FC）是构成细胞膜的主要成分之一，同时也是合成多种生理活性物质（如肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸和维生素D等）的重要前体。组织或细胞中FC的浓度变化是脂代谢状态的一项重要指标，其含量检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测心脑血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病等疾病监测：评估脂代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解脂代谢途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选降脂药物，用于治疗高血脂、脂肪肝等食品工业：评估食品品质、新鲜度和贮藏条件农业应用：研究植物抗逆性机制、果实成熟过程等

测定原理

比色法/COD-PAP法/分光光度法：血液中的胆固醇约1/3为游离胆固醇，2/3为与脂肪酸结合的胆固醇酯，后者被胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇；游离胆固醇被胆固醇氧化酶（COD）氧化成胆甾烯酮，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林与酚（三者合称PAP）反应，生成红色醌亚胺色素（Trinder反应），当CEH不存在时，胆固醇酯不能被水解，因而只能检测到游离胆固醇的含量，分光光度计在500~520nm处进行比色测定，用于定量测定人或动物的血清、血浆、脑脊液。

ELISA法：采用双抗体夹心法，将游离胆固醇与特异性抗体结合，通过酶标二抗检测结合的游离胆固醇，根据吸光度值计算游离胆固醇含量。

试剂盒组成

比色法/COD-PAP法/分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的FC

试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 粉剂×1瓶 含胆固醇氧化酶（COD），反应底物

试剂三 粉剂×1瓶 含过氧化物酶（POD）、4-氨基安替比林与酚（PAP），显色剂

标准品 1mL×1支 含FC标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗FC单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗FC抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.1-10ng/mL FC标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

比色法/COD-PAP法/分光光度法：分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

动物组织样本取样：称取约0.1g组织，加入1mL无水乙醇匀浆：在冰上匀浆离心：以8,000g离心10分钟，4℃，使用上清液进行测定，并放置在冰上进行测试

细胞或细菌样本收集：收集5×10^6个细胞或细菌到离心管中，在离心后弃去上清液破碎：加入1mL无水乙醇，在冰浴中超声破碎细胞或细菌5分钟（功率20%或200W，超声3秒，间隔7秒，重复30次）离心：以8,000g离心10分钟，4℃，使用上清液进行测定，并放置在冰上进行测试

血清(浆)样品

血清(浆)样品：直接检测

植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

比色法/COD-PAP法/分光光度法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500~520nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入10mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入20mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后37℃水浴15min，记录500~520nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将FC标准品稀释成0、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1μmol/L系列浓度，同样处理，测定500~520nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

mmol/L：每升样本中FC的含量

mmol/g 鲜重：每克组织中FC的含量

ng/mL：每毫升样本中FC的含量

比色法/COD-PAP法/分光光度法计算公式

FC含量(mmol/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数FC含量(mmol/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数 FC含量(mmol/g 鲜重)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数×V总m×1000FC含量(mmol/g 鲜重)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数×m×1000V总

V总：样本匀浆液总体积（mL）

m：组织样本取样量（g）

ELISA法计算公式

FC含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数FC含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 比色法/COD-PAP法/分光光度法 ELISA法

线性范围 0~13mmol/L 0.1-10ng/mL

最低检测限 ≤0.031mmol/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤2.2% CV≤3.8%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免FC被氧化；-20℃可保存3个月，-80℃可保存1年

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

检测FC的血清或血浆宜用EDTA或肝素抗凝，如不能及时测定，密闭保存，4℃可稳定1周，-20℃可以稳定半年以上

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定，结果乘以稀释倍数

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

该试剂盒既可作终点法检测，又可作速率法检测

本法不适于检测总胆固醇的浓度，如需检测总胆固醇(TC)含量，请选择相关产品

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