中文名：miRNA小量制备试剂盒
英文名：miRNA miniprep Kit
货号：M598102
包装：250t、50t
存储温度：室温
产品介绍：
本试剂盒用于从各种动物组织、植物组织和细胞中提取miRNA。提取的miRNA 分子完整、纯度高，适用于Northern Blot 、Real-TimePCR、miRNA微列阵芯片、原位杂交、RNase保护测定等各种分子生物学实验
组分：
应用范围：
核酸提取及纯化
使用方法：
一、实验准备：
1.所有试剂用DEPC处理过的溶剂配制。请选用RNase-free枪头和离心管，以避免提取过程中RNA被RNase降解。
2.70%乙醇,- 20C预冷。
二、操作步骤：
不同的样品提取miRNA的操作中略有区别，具体步骤分述如下：
【从动物组织中提取miRNA】
1.取20-40 mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。
请按下面说明使用组织的量：
①RNA丰富的组织(如肝脏)：不超过30 mg
②RNA含量低的组织(如肌肉)：不超过100 mg
③当使用的组织量小于20 mg时：R-I，R- II和异丙醇的使用量都减半
④当使用的组织量大于40 mg时：R-I，R-II和异丙醇的使用量按比例增加
2.加入400 ul Buffer R- I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5 m|离心管(试剂盒内提供)中。
3.加入150 μl BufferR-1l,漩涡振荡15-30 s，12,000X g离心5 min。【建议在4℃下离心】
4.取上清至1.5 ml离心管中，加入180 u无水乙醇，混和均匀。
5.将制备管置于2 m|离心管(试剂盒内提供)中，转移步骤4中的混合液到制备管中，12,000X g离心1 min。【①建议在4℃下离心；②miRNA在滤液中，注意保存滤液。】
6.弃制备管，在滤液中加入500 μl异丙醇，混和均匀。
7.12,000X g离心10 min,弃上清。
8.加入700 μl 70%乙醇( - 20℃预冷)，12,000Xg离心5min.
9.弃上清,室温干燥5- 10 min。
10.离心管中加入70 ul Buffer TE (nucdease-free) 或RNase-free水洗脱miRNA。
【从植物组织中提取miRNA】
1.取30-150 mg组织，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。
请按下面说明使用组织的量：
①植物叶子：通常用量10-80 mg
②植物纤维组织：通常用量100-150 mg
③当植物叶组织量小于30 mg时：R-I，R-II和异丙醉的使用量都减半
④当植物叶组织量大于80 mg时：R-I，R-II 和异丙醇的使用量按比例增加
⑤当植物纤维组织量大于150 mg时：R-I，R- II和异丙醇的使用量按比例增加
2.加入400 ul BufferR- I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5 mI离心管( 试剂盒内提供)中。.
3.加入150 ul Buffer R-1I,漩涡振荡15-30 s, 12.000x g离心5 min。【 建议在4℃下离心】
4.取上清至1.5 ml离心管中，加入180 山无水乙醇，混和均匀。
5.将制备管置于2 mI离心管(试剂盒内提供)中，转移步骤4中的混合液到制备管中，12.000xg离心1 min.【①建议在4℃下离心；②miRNA在滤液中，注意保存滤液。】
6.弃制备管，在滤液中加入500 μl异丙醇，混和均匀。
7. 12,000xg高心10 min,弃上清。
8.加入700 ul 70%乙醇( - 20℃预冷)，12,000xg离心5min.
9.弃上清,室温干燥5 -10 min,
10.离心管中加入70 μl Buffer TE (nuclease-free) 或RNase-free水洗脱MiRNA。
【从细胞中提取miRNA】
步骤1-3根据细胞培养的方式不同可以选择a或b两种实验方法
a.悬浮培养的动物细胞或从培养皿、培养瓶中获得的细胞悬浮液或新鲜分离的动物组织单细胞悬浮液:
1a.收集2X 10*-1X 10’的细胞，2,000Xg离心5 min，弃上清；
2a.加入400 μl BufferR- I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5mI离心管(试剂盒内提供)中；
3a. 加入150 μl Buffer R1I，旋涡振荡15-30s，12.000X g离心5 min.【建设在4℃下离心】。
b. 96-孔L, 24-孔,12-孔或6-孔培养板上贴壁培养的细胞:
1b.从96-孔， 24-孔，12-孔或6-孔培 养板里收集细胞，尽量弃去培养基，每孔加入400 u山l Buffer R-I，用移液枪上下吹打8-10次；
2b.转移上述细胞悬浮液到1.5 ml离心管( 试剂盒内提供)中，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次；
3b. 加入150 μl Bufflr R-II， 漩涡振荡15-30 s， 12,000X g离心5 min.【建议在4℃下离心】
4.取上清至1.5 ml离心管中，加入180 山无水乙醇，混和均匀。
5.将制备管置于2 ml离心管(试剂盒内提供)中，转移步骤4中的混合液到制备管中，12.000Xg离心1 min。【①建议在4℃下离心；②miRNA在滤液中，注意保存滤液。】
6.弃制备管，在滤液中加入500 u异丙醇，混和均匀。
7.12,000Xg高心10 min,弃上清。
8.加入700 μ 70%乙醇( - 20℃预冷)，12,000xg离心5min.
9.弃上清,室温干燥5 -10 min.
10.离心管中加入70 ul Bufer TE (nucdease-free )或RNase-free水洗脱mRNA。
三、流程图
注意事项：
Buffer R- I含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
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