琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒

琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒说明书

                                        分光光度法 50管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒测定意义：

SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

测定原理：

SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2．6-DPIP的还原速度，代表SDH酶活性。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入2mL蒸馏水，用不完的试剂仍4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，用不完的试剂4℃保存。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆600g，4℃离心5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的SDH（此步可选做）。

在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体SDH活性测定。

琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒测定步骤和加样表：

37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）保温10min左右

用蒸馏水调零后，依次加各试剂到1 mL玻璃比色皿中，在加入试剂六的同时开始计时，混匀，在600 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和1分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

SDH活性的计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

 SDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=304.6×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.609×ΔA

V反总：反应体系总体积，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。