深度拆解 AKT 靶点：爆款抗癌药背后的通路密码

近期来凯医药与齐鲁制药达成合作，AKT 抑制剂 LAE002 国内权益授权落地，合作里程碑总额超 20 亿元，叠加阿斯利康首款 AKT 靶向药成功商业化，让 PI3K/AKT/mTOR 通路一跃成为实体瘤研发的热门方向。

一、AKT 通路：细胞调控枢纽，异常激活诱发肿瘤

AKT 又称蛋白激酶 B，是调控细胞存活、增殖、血管新生的核心枢纽。生理条件下，生长因子激活 PI3K 生成 PIP3，诱导 AKT 磷酸化活化，逐级激活 mTOR 通路完成正常细胞代谢；PTEN 蛋白如同通路刹车，平衡 PIP3 含量，防止通路异常亢进。

一旦出现 PTEN 缺失、PI3K/AKT 基因突变，通路会持续失控，癌细胞规避凋亡、无限增殖，还会催生新生肿瘤血管，同时也是肿瘤靶向、化疗耐药的重要诱因，在乳腺癌、前列腺癌等病种高发。

From：QI H, FAN L. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2010;13(12):1149-1154. doi:10.3779/j.issn.1009-3419.2010.12.13

二、全球研发竞速，国产 AKT 抑制剂迎来突围

目前全球仅有阿斯利康 Capivasertib 获批上市，用于 HR 阳性晚期乳腺癌，上市首年销售额近 4 亿美元，巨大临床价值吸引海内外药企布局：

来凯医药 LAE002 可靶向全部三种 AKT 亚型，乳腺癌 III 期临床顺利开展，极有望成为全球第二款同靶点上市药物，同时拓展前列腺癌适应症；恒瑞、正大天晴自研候选药也已先后迈入临床试验。而默沙东、礼来、罗氏早期多款 AKT 候选药接连临床折戟，靶点选择性欠佳、脱靶毒性过高是失败主因。

三、药物筛选五大核心体外检测方案

新药前期筛选，依靠多套成熟实验体系评价抑制剂药效：

通路磷酸化检测：依托 THUNDER TR-FRET 均相荧光技术，免洗操作快速检测 AKT（Ser473/Thr308）、GSK3β 等关键蛋白磷酸化程度，利用乳腺癌 MCF7 细胞快速筛选有效化合物；

Phospho-GSK3β (S9)为例

用Insulin处理MCF7细胞（75000个细胞/孔）与IGF-1在室温下孵育30分钟。EC50为9.6nM。抑制剂UCN-01实验中，用UCN-01室温孵育MCF7细胞（75000个细胞/孔）2小时，再用Insulin孵育30分钟，可以看到GSK3β在S9位点磷酸化被抑制。

图. THUNDER Phospho- GSK3β（S9）验证数据

细胞活力测定：CCK8、CTG、LDH 等试剂，直观统计给药后肿瘤细胞存活状态；

细胞凋亡检测：UA-Glo 发光试剂盒定量 Caspase3/7 活性，判断药物诱导癌细胞凋亡的能力；

标志物定量：TR-FRET 技术检测 VEGF、颗粒酶 B，分别评估药物对肿瘤血管生成与抗肿瘤免疫的调控效果；

以Human VEGF为例

THUNDER细胞因子检测是基于双抗体夹心法，标记荧光供体和受体的VEGF抗体Eu-Ab1和FR-Ab2，分别与细胞上清中VEGF结合，产生能量共振转移FRET（615nm），进而产生665nm荧光信号，荧光信号强度与VEGF浓度成正比。全程仅需1.5h，免洗，可高通量。检测灵敏度高，上限宽，检测范围：14-30,000pg/ml

细胞代谢检测：追踪葡萄糖摄入、乳酸分泌与 ATP 水平变化，从代谢层面验证药物作用机理。