细胞凋亡笔记来啦！

✅核心：区分凋亡（主动、无炎症、凋亡小体）vs 坏死（被动、炎症）

✅染料：DNA特异性蓝色荧光染料染细胞核

正常细胞 = 淡蓝均匀荧光

凋亡细胞 = 核固缩、荧光高亮、凋亡小体

📌实验流程：铺板→yao诱导凋亡→固定→染色→荧光镜观察

一、实验目的

1.掌握细胞凋亡的核心概念、形态特征与生理病理意义，区分细胞凋亡与细胞坏死的本质差异。

2.熟练掌握常用细胞凋亡检测方法的实验原理与操作流程。3.观察正常细胞与凋亡细胞的形态学差异，识别典型的细胞凋亡形态特征，初步学会凋亡细胞的判定与结果分析。4.理解药物诱导细胞凋亡的作用机制，建立细胞水平的程序性死亡实验认知。

二、实验原理

细胞凋亡是基因调控的主动程序性out，具有核固缩、染色质凝聚、核碎裂、形成凋亡小体等特征，无内容物外泄、不引起炎症，与被动损伤导致的细胞坏死不同。DNA特异性蓝色荧光染料，可穿透活细胞和凋亡细胞。正常细胞核呈均匀淡蓝色荧光;凋亡细胞核固缩、染色加深、荧光高亮，可见凋亡小体。本实验通过药物诱导细胞凋亡，利用荧光染色观察并判定细胞凋亡情况。

三、实验步骤

1.细胞铺板培养

取对数生长期的贴壁细胞，弃去旧培养基，PBS缓冲液清洗2次，加入胰蛋白酶消化，待细胞形态变圆、轻微脱壁后，加入完全培养基终止消化，吹打制成均匀细胞悬液。调整细胞浓度为5x104个/mL，接种于细胞培养皿中，置于37°C、5%CO2恒温培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长。

2.细胞凋亡模型构建

实验设置两组:空白对照组(正常培养细胞)、凋亡诱导组(加入适宜浓度凋亡诱导剂)。弃去培养皿中旧培养基，对照组更换新鲜完全培养基，诱导组更换含凋亡诱导剂的培养基，继续恒温培养24h，诱导细胞发生凋亡。

3.细胞固定处理

培养结束后，弃去各组培养基，PBS缓冲液轻柔清洗细胞3次，每次3min，去除残留培养基与杂质。每皿加入适量4%多聚甲醛，室温固定15min，固定完成后弃去固定液，再次用PBS清洗3次，去除残留固定液，避免影响染色效果。

4.荧光染色

向各组细胞培养皿中加入足量DNA特异性蓝色荧光染料染色液，完全覆盖细胞层，置于避光孵育盒中室温避光染色15-20min。染色结束后，弃去染色液，PBS轻柔清洗2次，洗去游离染料，减少背景荧光干扰。

5.显微观察与拍照

将处理好的细胞样本置于倒置荧光显微镜下，先以低倍镜观察整体细胞分布，再切换高倍镜，分别观察对照组与诱导组细胞的细胞核形态、荧光分布特征，选取典型视野拍照记录，对比两组细胞差异。

四、实验结果

1.空白对照组

对照组细胞形态完整、分布均匀，细胞核形态规则，呈均匀淡蓝色荧光，无核固缩、核碎裂及凋亡小体，几乎无凋亡细胞。

2.凋亡诱导组

诱导组细胞出现典型凋亡特征:细胞皱缩、体积变小，细胞核固缩，荧光明显增亮加深，可见核碎裂和凋亡小体，细胞凋亡现象显著。