【阿拉丁】DNA Pull-Down实验操作规程

一、原理与用途概述

1.1实验原理

DNA pull-down是一种体外DNA–蛋白相互作用检测与富集技术。其基本思路为：

（1）将含有待研究顺式作用元件（如启动子、增强子、沉默子或其他调控序列）的DNA片段进行生物素标记，作为“诱饵”探针；

（2）将生物素标记的DNA与链霉亲和素包被的固相载体（常用磁珠）结合，形成DNA-磁珠复合物；

（3）将DNA-磁珠复合物与蛋白样本（核提取物、总蛋白或纯化蛋白混合物）孵育，使与该序列特异结合的蛋白结合到DNA上；

（4）通过磁分离和梯度洗涤去除非特异结合蛋白，洗脱下来的蛋白即为该DNA片段的互作蛋白群；

（5）后续可通过Western Blot或质谱鉴定Pull-Down产物中的蛋白。

该方法依赖生物素–链霉亲和素高亲和配对，保证DNA探针稳定固定和高效富集DNA–蛋白复合物。

1.2主要应用

（1）解析基因表达调控机制

通过鉴定与启动子、增强子、沉默子等调控区域结合的转录因子及共调控复合物，阐明基因转录激活或抑制的分子基础。

（2）构建DNA–蛋白相互作用图谱

与ChIP-qPCR/ChIP-seq等体内实验结果互证，验证特定基因组区域的结合蛋白谱。

（3）疾病相关变异功能研究

分析疾病相关非编码区突变是否改变蛋白–DNA结合能力，从而导致基因表达失衡。

（4）药物靶点研究

筛选干扰关键蛋白–DNA结合的小分子或其他干预因子，为药物靶点发现与验证提供依据。

二、样本与试剂准备

2.1样本类型与推荐用量

（1）细胞样本

①细胞数量：约3×10⁷个细胞，或约3个10cm培养皿，细胞融合度80%–90%。

②收集后离心收集细胞沉淀，沉淀体积约80–100μL。

（2）动物组织样本

新鲜组织不少于0.5g，建议尽量缩短离体至处理的时间。

（3）植物组织样本

新鲜幼嫩组织不少于1g，避免老化和木质化严重组织。

（4）模板质粒（用于PCR制备DNA探针）

体积不少于20μL，浓度≥20ng/μL，低温运输保存。

（5）抗体（仅用于WB检测时）

Western Blot级别特异抗体≥10μL。

（6）注意事项

①经药物处理的细胞或组织，建议用预冷PBS清洗2次后再收集样本，以减少残留药物对蛋白活性和结合的干扰。

②全过程尽量在冰上或4℃条件下操作，减少蛋白降解。

2.2蛋白样本制备

（1）样本预处理

①细胞：直接PBS清洗后收集细胞沉淀。

②动物组织：剪碎后用预冷PBS充分冲洗，机械匀浆。

③植物组织：于液氮中研磨成细粉后迅速加入裂解液。

（2）裂解与抑制

①选择适合样本类型的冷裂解液（如核提取裂解液、IP裂解液或植物蛋白裂解液），加入适量蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

②裂解过程全程置于冰上孵育，定时轻轻颠倒混匀。

（3）超声破碎

①冰浴超声，典型参数可参考：功率约20%，工作3s/间歇3s。

②建议时间：动物组织约5min；细胞约2min；植物组织约10min。

③避免产生大量泡沫，减少蛋白机械剪切和降解。

（4）澄清与保存

①4℃，12000r/min离心10min，取上清作为总蛋白。

②使用前可测定蛋白浓度（BCA/Bradford等）。

③短期4℃保存，长期-20℃或-80℃保存，避免反复冻融，可分装。

2.3DNA探针设计与制备

（1）靶标区域明确且较短（数十至数百bp）时

①可直接化学合成带5’端生物素标记的双链DNA片段，作为Pull-Down探针。

（2）靶标区域不明确或需覆盖较大上游区域时

①通常以基因转录起始位点上游约2000bp为起始区域设计引物；

②引物一端标记生物素，通过PCR扩增获得上游约2kb的生物素标记DNA片段；

③PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认单一特异条带后，凝胶回收并纯化；

④定量后作为DNA pull-down探针。

（3）对照探针

①等长度、同样带生物素标记但不含结合位点（或结合位点突变/随机序列）的DNA作为阴性对照；或设置beads-only（无DNA）对照。

②或使用随机序列/无特定结合位点的生物素标记DNA作为非特异结合对照。

三、实验步骤

3.1磁珠预处理

（1）磁珠混匀

将链霉亲和素磁珠从4℃取出，上下颠倒轻柔混匀，使磁珠完全分散。

（2）分装

取约30μL磁珠至两个1.5mLEP管中，分别作为：

（1）实验组（生物素标记DNA）；

（2）对照组（同样带生物素标记的非特异DNA/结合位点突变探针；或设置beads-only（无DNA）对照）。

（3）洗涤

①将EP管置于磁力架上静置约1min，使磁珠完全吸附；

②弃上清；

③加入约500μL预冷核酸结合/PBS轻柔重悬磁珠；

④再置于磁力架上分离1min，弃上清；

⑤视需要重复1次。

3.2DNA与磁珠结合

（1）加入探针

①实验组：加入约1–5μg带生物素标记的DNA探针（短寡核苷酸探针可按约10–100pmol量级优化；长片段不宜按100–300pmol计量）。

②对照组：加入等量同样带生物素标记的非特异DNA（或结合位点突变探针）；或设置beads-only（无DNA）对照。

③各管用核酸缓冲液补足总体积至约500μL。

（2）孵育

①室温静置或轻微振荡孵育约2h，以促进生物素–链霉亲和素充分结合；

②孵育结束后，将管置于磁力架上吸附磁珠，保留上清备用（可用于评估结合效率）。

（3）洗涤

①各管加入约1mL核酸缓冲液重悬磁珠；

②磁分离1min，弃上清；

③重复洗涤3次，最后一次洗涤后尽量去除残余上清。

3.3DNA–蛋白结合

（1）加入蛋白样本

①每管加入总蛋白300–2000μg（可根据蛋白丰度与实验目的调整）；

②同时加入1mM PMSF等蛋白酶抑制剂；

③用蛋白孵育缓冲液补足至1mL总体积。

（2）设置Input

另取约100μL蛋白裂解液作为Input组，直接加入上样缓冲液后保存，用于后续对比。

（3）孵育条件

①4℃下旋转或轻微振荡孵育过夜（一般12–16h）；

②孵育结束后置于磁力架上分离，保留上清（可用于评估结合耗竭情况）。

（4）洗涤

①加入约1mL预冷蛋白孵育缓冲液，轻柔重悬磁珠；

②磁分离1min，弃上清；

③重复洗涤5次，以充分去除非特异结合蛋白；

④洗涤完成后，可在室温短暂复温约30min再进行洗脱，有助于部分复合物解离。

3.4洗脱与样品制备

（1）变性洗脱（常用于WB）

①加入约100μL洗脱缓冲液（如含SDS的上样缓冲液或适配体系）；

②95–100℃水浴或金属浴加热8–10min，使蛋白从DNA–磁珠上解离；

③磁分离或离心快速收集上清，即为Pull-Down洗脱蛋白样品；

④向上清中补足1×SDS-PAGE Loading Buffer，如前一步已使用上样缓冲液则可略去；

⑤再次快速煮沸3–5min，-20℃保存备用。

（2）Input处理

①Input组样品加入等体积2×Loading Buffer；

②煮沸变性3–5min，-20℃保存。

（3）用于质谱分析的额外处理

①若计划进行LC-MS/MS鉴定，最后一次洗涤前可留取约1/4磁珠悬液，转入新管；

②用PBS洗涤3次去除干扰成分；

③弃上清后磁珠直接-20℃保存，后续按质谱样品预处理流程操作。

3.5检测与结果分析

（1）Western Blot（针对已知候选蛋白）

①将Input、实验组Pull-Down、对照组Pull-Down样品进行SDS-PAGE分离；

②转膜后用针对候选蛋白的一抗进行WB；

③若实验组Pull-Down出现特异条带，而对照组无对应条带，提示该蛋白可与目标DNA特异性结合；

④若Input有条带而实验组Pull-Down无信号，需评估蛋白丰度、抗体性能与Pull-Down条件。

（2）银染与质谱（用于未知互作蛋白筛选）

①使用银染对Pull-Down样品进行高灵敏度检测，评估蛋白丰度与条带复杂度；

②在已知预期条带大小的前提下可定向切胶送质谱；

③或将样品整体上机LC-MS/MS，结合对照组数据过滤非特异背景。

四、结果解读要点

4.1结合是否特异

（1）实验组有明确条带而对照组无条带：

提示存在针对该DNA探针的特异结合蛋白。

（2）实验组与对照组均有相似条带：

提示存在较强非特异结合，需要优化条件（加竞争DNA、增加洗涤离子强度等）。

（3）三组（Input/实验组/对照组）均无目标蛋白条带：

首先评估目标蛋白在样本中是否存在（可用正常WB先检测）；若本底表达极低，建议进行过表达或更换样本。

4.2与体内数据的整合

DNA pull-down属于体外结合证据，通常建议与：

（1）ChIP-qPCR/ChIP-seq；

（2）报告基因实验；

（3）基因敲低/敲除后表型分析

等体内或功能实验互相印证，以增强生物学结论的可靠性。

五、常见问题与排查建议

5.1非特异性结合背景高

（1）优化DNA探针设计：

①避免重复序列与高度富含AT/GC的非特异性结合倾向区域；

②缩短探针长度，使其更聚焦于功能核心元件。

（2）加入竞争DNA：

①在孵育体系中加入适量非特异性竞争DNA（如Poly(dI·dC)或鲑鱼精子DNA（salmon sperm DNA）等），减少蛋白对非特异序列的结合。

（3）优化洗涤条件：

①提高洗涤缓冲液离子强度或增加少量非离子表面活性剂；

②适当增加洗涤次数或延长洗涤时间。

5.2目标蛋白结合信号弱或缺失

（1）保证蛋白活性

①使用新鲜制备的核提取物或总蛋白，避免多次冻融；

②全程冰上操作，加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂。

（2）优化孵育条件

①优先选择4℃旋转孵育过夜，使结合达到平衡；

②对于已知亲和力较强互作，可尝试缩短至1–2h室温孵育。

（3）增加探针或蛋白用量

①确保探针量对目标蛋白为过量，以利于完全捕获；

②在不引起明显蛋白降解的前提下适度增加蛋白上样量。

5.3WB信号弱或检测灵敏度不足

（1）样品浓缩

①对洗脱液使用丙酮沉淀或TCA沉淀以浓缩蛋白，减少体积后上样；

（2）直接上样磁珠

①某些情况下可将磁珠–蛋白复合物与2×上样缓冲液直接混合煮沸，全部上胶，以减少洗脱过程的损失。

（3）提高检测灵敏度

①选用高灵敏度化学发光底物或荧光检测系统；

②确保一抗/二抗特异性良好且稀释度合适。

5.4质谱实验的定量选择

（1）仅需鉴定互作蛋白种类

可采用非定量LC-MS/MS，重点筛选实验组特有或显著富集的蛋白。

（2）需要比较不同条件/处理间差异

例如对比空白对照与目标蛋白过表达样本下的互作谱差异，建议采用定量质谱（如标记或无标记定量）策略，以获得更可靠的差异蛋白信息。

六、安全注意事项

（1）样本中可能含有潜在生物危害成分，操作时应佩戴实验室标准防护（手套、实验服、护目镜），并遵守生物安全规范。

（2）含蛋白、DNA、SDS等的废液应分类收集，按照实验室危险废物处理流程统一处理。

（3）使用超声破碎仪和高温水浴时，注意防烫、防噪声和设备安全。

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